QPCR
QPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction)，即实时荧光定量 PCR (Real-Time PCR)，是一种在 DNA 扩增反应中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线或内参对照对未知模板进行定量分析的分子生物学技术。与传统的 终点法PCR（End-point PCR）不同，QPCR 能够精确定量起始模板的拷贝数或相对表达量。它是目前生物医学研究中分析 基因表达 水平的金标准，也是临床诊断中病原体检测（如 COVID-19 核酸检测）的核心技术。
核心原理：Ct 值与指数增长
QPCR 的定量基础在于 PCR 反应的指数扩增期。在此阶段，产物量与起始模板量呈严格的对数线性关系。
- 阈值循环数 (Ct / Cq Value)： 这是 QPCR 最重要的数据。指荧光信号强度达到设定的阈值线（Threshold）时所经历的循环数。Ct 值与起始模板拷贝数的对数成反比：起始模板越多，荧光积累越快，Ct 值越小。
- 荧光化学体系：
• 染料法 (SYBR Green)： 嵌入所有双链 DNA 发光。成本低，通用性强，但会结合引物二聚体，需做熔解曲线验证特异性。
• 探针法 (TaqMan)： 利用 5'端荧光基团和 3'端淬灭基团。特异性高，可实现多重检测（Multiplexing），是临床诊断首选。
数据分析：相对 vs. 绝对
| 定量方法 | 原理与公式 | 典型应用场景 |
|---|---|---|
| 相对定量 (Relative) | 2-ΔΔCt 法： 比较目的基因相对于内参基因（如 GAPDH, β-actin）在处理组与对照组之间的变化倍数。 | 药物处理后的基因表达差异分析、RNA干扰效率验证。 |
| 绝对定量 (Absolute) | 标准曲线法： 使用已知浓度的标准品（质粒或合成DNA）梯度稀释，构建 Ct 值-浓度标准曲线，反推未知样本浓度。 | 病毒载量检测（如乙肝 HBV-DNA）、转基因拷贝数测定。 |
临床与科研地位：不可或缺的工具
尽管 NGS 和 数字PCR 兴起，QPCR 凭借其速度、成本和成熟度，依然是中流砥柱：
- 病原体确诊： 具有“金标准”地位。全封闭反应体系极大降低了气溶胶污染导致的假阳性风险，是传染病防控的第一道防线。
- 基因分型： 利用特异性探针，可快速鉴定 SNP 位点，用于药物基因组学（如华法林代谢基因检测）。
- 验证工具： 转录组测序（RNA-Seq）的大数据结果，通常需要通过 QPCR 进行实验验证（Validation）。
关键相关概念
学术参考文献与权威点评 [Academic Review]
[1] Higuchi R, et al. (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology. 11(9):1026-1030.
[权威点评]：该研究是 qPCR 的奠基之作，Russell Higuchi 首次展示了通过在 PCR 反应中加入溴化乙锭并监测荧光，可以实现实时定量。
[2] Heid CA, et al. (1996). Real time quantitative PCR. Genome Research. 6(10):986-994.
[学术点评]：介绍了双荧光标记探针（TaqMan）技术，极大地提高了检测的特异性，为临床诊断应用铺平了道路。
[3] Bustin SA, et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55(4):611-622.
[学术点评]：针对 qPCR 领域数据质量参差不齐的现状，提出了具有里程碑意义的 MIQE 指南，成为行业操作规范。