数字PCR
数字PCR (Digital PCR, dPCR) 是继第一代普通 PCR 和第二代 实时荧光定量PCR (qPCR) 之后的第三代核酸扩增技术。其核心原理是将一个标准的 PCR 反应体系物理分割成成千上万个独立的微小反应单元（微滴或芯片微孔），使得每个单元中包含 0 个或 1 个靶分子。经过扩增后，通过统计发光单元（阳性）和不发光单元（阴性）的数量，结合 泊松分布 模型，直接计算出靶分子的起始 绝对拷贝数。dPCR 无需依赖标准曲线，具有极高的灵敏度、精确度和抗干扰能力，被誉为核酸检测领域的“黄金标准”。
技术原理：从模拟到数字的跨越
dPCR 的工作流程打破了传统 PCR 对扩增效率的依赖，通过“有限稀释”实现数字化计数：
- 样本分割 (Partitioning)： 这是 dPCR 的灵魂。利用 微流控 或微机电加工技术，将含有核酸模板的反应液分割成数万（ddPCR）甚至数百万（cdPCR）个纳升级别的独立微单元。
- 独立扩增 (PCR Amplification)： 每个微单元作为一个独立的 PCR 反应器进行热循环。含有模板的单元发生扩增并产生荧光（“1”），不含模板的单元无荧光（“0”）。
- 泊松校正 (Poisson Correction)： 虽然通过极度稀释，但仍可能存在一个微滴包含 2 个或更多靶分子的情况。泊松分布公式 $\lambda = -\ln(1 - k/n)$（其中 $k$ 为阳性微滴数，$n$ 为总微滴数）可精确校正这一偏差，计算出真实的浓度。
技术流派：微滴 vs. 芯片
| 分类 | 微滴数字PCR (ddPCR) | 芯片数字PCR (cdPCR) |
|---|---|---|
| 分割方式 | 利用油包水乳化技术生成悬浮的微液滴。 | 利用物理微孔板（如硅片或塑料）上的微阵列孔。 |
| 单元数量 | 通常 20,000 个左右。 | 可达 20,000 至数百万个，分区更稳定。 |
| 优缺点 | 优点：成本相对较低，通量灵活。 缺点：液滴大小均一性受油相影响。 |
优点：体积固定，数据质量高。 缺点：芯片制造成本昂贵。 |
核心应用：精准医疗的度量衡
dPCR 解决了 qPCR 在微量样本和复杂背景下定量不准的痛点，主要应用于：
- 稀有突变检测： 如 液体活检 中 ctDNA 的 EGFR T790M 或 KRAS 突变检测。dPCR 能在数万个野生型背景中精准识别出几个突变分子（0.01% VAF）。
- 拷贝数变异 (CNV) 分析： 精确区分 1.5 倍的差异（如 2 拷贝 vs 3 拷贝），是 HER2 扩增、SMA 携带者筛查的金标准。
- 标准物质定值： 由于其绝对定量的特性，dPCR 常被计量机构用于为 qPCR 试剂盒的标准品进行定值（Reference Material Assignment）。
关键相关概念
学术参考文献与权威点评 [Academic Review]
[1] Vogelstein B, Kinzler KW. (1999). Digital PCR. PNAS. 96(16):9236-9241.
[权威点评]：开创性文献，Bert Vogelstein 首次提出了“Digital PCR”的概念，将核酸检测从模拟信号时代带入了数字时代。
[2] Hindson BJ, et al. (2011). High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83(22):8604-8610.
[权威点评]：标志着 ddPCR 技术的商业化成熟，详细验证了其在绝对定量和 CNV 分析方面超越 qPCR 的性能。
[3] Huggett JF, et al. (2013). The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59(6):892-902.
[学术点评]：制定了 dPCR 实验报告的国际标准（dMIQE），规范了术语和数据分析流程，推动了技术的标准化应用。