RT-qPCR

RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative PCR)，即逆转录实时荧光定量 PCR，是一种将 RNA 逆转录（Reverse Transcription）与实时荧光定量 PCR（qPCR）相结合的分子生物学技术。该技术首先利用 逆转录酶 将 RNA 模板转化为互补 DNA (cDNA)，随后以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增。RT-qPCR 是目前检测 基因表达 水平（mRNA 丰度）和 RNA 病毒（如 SARS-CoV-2、流感病毒）载量的“金标准”，具有极高的灵敏度、特异性和宽广的动态范围。

RT-qPCR

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Conceptual Model:
RNA → cDNA → Fluorescence

核心流程：逆转录 + 扩增

起始模板	Total RNA / mRNA / Viral RNA
关键酶	逆转录酶 (RT) + DNA聚合酶
策略分类	一步法 / 两步法
引物类型	Oligo(dT) / 随机六聚体 / 特异性引物
主要风险	gDNA污染 / RNA降解
应用领域	病原检测 / 转录组验证

技术路径：一步法 vs. 两步法

根据逆转录和 PCR 扩增是否在同一管中进行，RT-qPCR 分为两种主要策略：

• 一步法 (One-step RT-qPCR)： 逆转录和 PCR 在同一反应管中连续完成。
  优势： 操作简便，减少移液误差，降低交叉污染风险（适合高通量筛查，如 COVID-19 检测）。
  劣势： 灵敏度略低，无法留存 cDNA 供后续复测。
• 两步法 (Two-step RT-qPCR)： 先将 RNA 逆转录为 cDNA，再分装 cDNA 进行 qPCR。
  优势： 灵活性高，一管 cDNA 可检测多个靶基因，适合稀有样本和基因表达分析。
  劣势： 步骤多，耗时长，污染风险相对较高。

关键质控点：确保数据可靠性

质控环节	潜在问题	解决方案 (MIQE建议)
RNA 质量	RNA 降解导致 Ct 值滞后，定量不准。	检测 RIN值 (RNA Integrity Number)，要求 > 7.0。
基因组 DNA 污染	引物扩增了 gDNA 导致假阳性（尤其在内含子未知的病毒检测中）。	使用 DNase I 处理 RNA，或设计跨内含子引物 (Exon-spanning primers)。
逆转录效率	RT 效率随引物类型（Oligo dT vs 随机引物）和二级结构变化。	使用混合引物策略，并设置内参基因进行标准化。

应用领域：从基础到临床

RT-qPCR 的应用贯穿了生命科学的各个层面：

• 传染病诊断： 检测 HIV、HBV、SARS-CoV-2 等 RNA 病毒的载量，用于确诊和疗效监测。
• 肿瘤学： 检测 融合基因（如 BCR-ABL1）mRNA 水平，用于白血病的诊断和微小残留病 (MRD) 监测。
• 科研验证： 对 RNA-Seq 或 基因芯片 筛选出的差异表达基因进行“金标准”验证。

关键相关概念

• cDNA (互补DNA)： 以 RNA 为模板逆转录合成的 DNA，无内含子，比 RNA 稳定。
• 逆转录酶 (Reverse Transcriptase)： RNA 依赖的 DNA 聚合酶，常用 M-MLV 或 AMV 来源。
• 跨内含子引物： 上下游引物分别位于不同的外显子，中间跨越一个内含子，防止扩增 gDNA。
• 无RT对照 (-RT Control)： 反应中不加逆转录酶，若产生信号则说明存在 gDNA 污染。

       学术参考文献与权威点评 [Academic Review]
       

[1] Bustin SA. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25(2):169-193.
[权威点评]：该综述被誉为 RT-qPCR 的“圣经”，详细阐述了从 RNA 提取到数据分析的每一个技术细节和潜在陷阱。

[2] Nolan T, Hands RE, Bustin SA. (2006). Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1(3):1559-1582.
[学术点评]：提供了标准化的 RT-qPCR 实验流程（Protocol），重点讨论了如何选择内参基因和优化逆转录步骤。

[3] Corman VM, et al. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25(3):2000045.
[学术点评]：Charité 柏林团队发表的全球首个 SARS-CoV-2 检测方案，确立了 RdRp 和 E 基因作为 RT-qPCR 的靶标，是全球抗疫的技术基石。

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