Knock-in
基因敲入（Gene Knock-in，简称 KI）是一种利用基因组编辑技术，将外源 DNA 序列精准插入到基因组特定位点的技术。与破坏基因功能的 Knock-out (KO) 不同，KI 旨在赋予细胞新的功能（如插入 CAR 基因）或修复致病突变（如修正点突变）。
相比于传统的慢病毒/转座子介导的随机整合（可能导致插入突变或癌变），KI 具有高度的位置特异性。它通常依赖于 HDR (同源介导修复) 通路，需要同时提供核酸酶（如 Cas9）和含同源臂的供体模板。在下一代细胞治疗中，将治疗性基因敲入TRAC 等内源性位点，已成为提升疗效和安全性的金标准。
核心机制：从破坏到建设
基因敲入的技术难度远高于基因敲除。如果说 KO 是“破坏”，那么 KI 就是“重建”。
- 依赖 HDR： 经典的 KI 依赖 HDR 通路。除了 Cas9 切割产生的 DSB 外，必须提供含有同源臂的供体模板（ssODN 或质粒）。细胞利用同源臂进行重组，将供体中间的序列“拷贝”进基因组。
- HITI 策略： 对于不分裂细胞（HDR 不活跃），可以使用 HITI (Homology-Independent Targeted Integration)。该策略在供体两侧加上 Cas9 切割位点，利用 NHEJ 实现外源片段的连接。
- 先导编辑 (Prime Editing)： 最新的 PE 技术无需外源供体 DNA 和 DSB，直接利用 pegRNA 和逆转录酶在基因组原位“写入”几十 bp 的短序列，是小片段 KI 的革命性工具。
位点选择：寻找安全港
为了避免外源基因插入激活原癌基因（Insertional Mutagenesis）或被细胞沉默，KI 通常选择特定的基因组“安全港位点” (Safe Harbor Loci)。
| 位点 | 染色体位置 | 特点 |
|---|---|---|
| AAVS1 | 19q13.4 | 被认为是人类基因组最安全的位点。处于开放染色质区，转录活跃，且插入后不影响邻近基因。 |
| Rosa26 | 3p25.3 (人) | 小鼠模型中的金标准位点，在人类中同样有效。支持外源基因的全身性、组成型表达。 |
| TRAC | 14q11.2 | T 细胞受体 α 链恒定区。CAR-T 领域的明星位点。插入 CAR 的同时破坏内源 TCR，实现“一石二鸟”。 |
临床前沿：TRAC-CAR-T
在传统的 CAR-T 制备中，慢病毒随机整合会导致 CAR 表达水平不均一，且存在致瘤风险。利用 CRISPR/Cas9 将 CAR 基因定点敲入 TRAC 位点带来了革命性突破：
- 内源性调控： CAR 的表达受内源 TCR 启动子调控，随 T 细胞激活状态动态变化，避免了持续高表达导致的T细胞耗竭（Exhaustion）。
- 通用型 (UCART)： 敲入的同时破坏了内源 TCR 基因，消除了移植物抗宿主病（GvHD）的风险，使得异体 CAR-T 成为可能。
- 均一性： 每个细胞通常只有 1-2 个拷贝的 CAR，批次间一致性极高。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Eyquem J, et al. (2017). Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature.
[点评]：KI 领域的里程碑之作。证明了定点敲入 TRAC 位点的 CAR-T 细胞比随机整合的细胞具有更强的抗肿瘤活性和持久性。
[2] Suzuki K, et al. (2016). In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature.
[点评]：开发了 HITI 技术，解决了在非分裂细胞（如神经元）中无法进行传统 HDR 敲入的难题。
[3] Anzalone AV, et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature.
[点评]：先导编辑 (Prime Editing) 的开山之作，实现了无需外源供体 DNA 的小片段精准敲入。