SsODN
ssODN（Single-stranded Oligodeoxynucleotides，单链寡核苷酸）是指通过化学合成制备的、长度通常在 200 nt 以内的单链 DNA 片段。在 CRISPR-Cas9 基因编辑技术中，ssODN 是进行精准基因修饰（如点突变修复、引入短标签）的首选供体模板 (Donor Template)。
相比于双链 DNA（如质粒），ssODN 具有合成周期短、毒性低、整合效率高且不发生随机整合的优势。通过特定的设计策略（如不对称同源臂和末端硫代修饰），ssODN 能够高效激活 HDR 通路，是构建细胞模型和基因治疗（如修复镰刀型贫血突变）的核心工具。
黄金法则：不对称与静默突变
ssODN 的设计直接决定了 HDR 的效率。传统的对称设计（如切口两侧各 50bp）已被证明不是最优解。
- 1. 不对称同源臂 (Asymmetric Arms)： Richardson 等人 (Nature Biotech, 2016) 发现，Cas9 切割后会释放非靶向链（Non-target strand）的 PAM 远端。
优化策略： 设计 ssODN 与非靶向链互补，且在 PAM 远端（Distal）保留较长序列（如 90bp），近端（Proximal）较短（如 36bp）。这种设计能更快地与解离的基因组 DNA 杂交。 - 2. 引入静默突变 (Silent Mutation)： 这是一个新手常犯的错误。如果 ssODN 修复后的序列仍然保留完整的 sgRNA 靶点和 PAM 序列，Cas9 会反复切割修复好的 DNA，直到 NHEJ 产生 Indel 破坏靶点为止。
解决： 必须在 ssODN 中突变 PAM 序列（如 NGG $\rightarrow$ NGT），或在 Seed 区域引入同义突变，确保“修复即终止”。 - 3. 切口距离： 待突变的位点距离 Cas9 切割位点（Cut site）越近越好，最好在 10 bp 以内。随着距离增加，HDR 效率呈指数级下降。
化学修饰：给 DNA 穿上铠甲
外源输入的 ssODN 进入细胞后，极易被细胞质中的核酸外切酶降解，导致有效浓度不足。
| 修饰类型 | 化学结构 | 功能与效果 |
|---|---|---|
| 硫代修饰 (PS) | 磷酸骨架上的一个氧原子被硫原子取代。 | 抗降解。通常在 5' 和 3' 末端的最后 3 个碱基进行修饰（如 A*C*G...T*T*C）。可显著提高 HDR 效率 2-5 倍。 |
| 5' 端磷酸化 | 5'端增加磷酸基团。 | 通常不需要。除非用于特殊的连接反应。在常规 HDR 中，未磷酸化的 ssODN 效果更好，且能避免多聚体形成。 |
选型指南：ssODN vs 质粒
何时选择 ssODN，何时选择双链 DNA（dsDNA/Plasmid）？
● 选择 ssODN： 插入片段较短（< 50 bp）。例如：点突变（SNV）、引入终止密码子、引入 LoxP 位点、引入短标签（6xHis, FLAG, HA）。ssODN 整合效率高，且不会像质粒那样发生随机整合（Random Integration）。
● 选择质粒/AAV： 插入片段较长（> 100 bp）。例如：敲入 GFP 荧光蛋白、抗性基因、CAR 分子。此时 ssODN 合成困难且容易断裂，必须使用带有长同源臂（> 500 bp）的双链 DNA。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Richardson CD, et al. (2016). Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.
[点评]：经典文献。提出了著名的“不对称同源臂”设计原则（PAM 远端长，近端短），极大提升了 ssODN 的 HDR 效率。
[2] Renaud JB, et al. (2016). Improved genome editing efficiency and flexibility using modified oligonucleotides with CRISPR/Cas9. Cell Reports.
[点评]：系统验证了硫代修饰（Phosphorothioate）对 ssODN 稳定性的保护作用，确立了末端修饰为标准操作。
[3] Okamoto S, et al. (2019). Precise genome editing via single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODN). International Journal of Molecular Sciences.
[点评]：综述了 ssODN 在不同物种和细胞类型中的应用策略，特别是关于 ssDNA 长度与整合效率的关系。