Knock-out
基因敲除（Gene Knock-out，简称 KO）是指通过基因工程手段，使基因组中特定基因的序列发生永久性破坏，从而导致其编码的蛋白质功能完全丧失（Loss of Function, LOF）的技术。
在 CRISPR-Cas9 时代，KO 主要依赖细胞内源性的 NHEJ 修复通路。Cas9 切割 DNA 产生双链断裂后，NHEJ 引入的随机 Indel（插入缺失）会导致移码突变，使基因转录出的 mRNA 出现提前终止密码子，最终被降解或产生无功能的截断蛋白。与暂时性抑制基因表达的 Knock-down (KD) 不同，KO 是基因组水平上的、可遗传的永久性改变。
核心原理：制造混乱
基因敲除并非真正把基因“拿走”，而是通过引入错误，让基因变成“乱码”。
- 1. 引入 DSB： 使用 sgRNA 引导 Cas9 核酸酶在目标基因的编码区（Exon，通常选前几个外显子）进行切割。
- 2. 易错修复 (NHEJ)： 细胞紧急调用 NHEJ 修复断裂。由于没有模板，修复过程常发生 1-10 bp 的随机插入或缺失 (Indel)。
- 3. 移码 (Frameshift)： 只要 Indel 的长度不是 3 的倍数，开放阅读框（ORF）就会发生错位。
- 4. 提前终止： 错位的序列很快会遇到随机出现的提前终止密码子 (PTC)。含有 PTC 的 mRNA 会被细胞的质量监控机制——无义介导的 mRNA 降解 (NMD) 通路识别并销毁，或翻译成无功能的截断蛋白。
概念辨析：Knock-out vs Knock-down
这是生物学研究中最易混淆的两个概念，前者是“死刑”，后者是“禁言”。
| 特性 | Knock-out (KO) | Knock-down (KD) |
|---|---|---|
| 操作水平 | DNA (基因组) | RNA (转录后) |
| 持续性 | 永久，可遗传给子代细胞。 | 暂时 (siRNA) 或长期 (shRNA)，但不可遗传给后代个体。 |
| 抑制程度 | 100% (完全缺失) | 部分 (通常 70%-90%，有残留) |
| 主要工具 | CRISPR-Cas9, TALENs | RNAi (siRNA, shRNA), ASO |
临床里程碑：用破坏来治愈
2023 年获批的全球首款 CRISPR 基因编辑疗法 Casgevy (Exa-cel)，其核心机制就是 Gene Knock-out。
● 原理： 镰刀型贫血患者的 $\beta$-珠蛋白突变。Casgevy 并没有去修复这个突变，而是敲除了 BCL11A 基因的增强子区域。
● 逻辑： BCL11A 是一个“刹车”蛋白，负责在出生后抑制胎儿血红蛋白 (HbF) 的表达。通过 KO 掉这个刹车，患者体内的 HbF 重新表达，从而代偿了缺陷的成人血红蛋白。这是一个经典的“负负得正”的治疗策略。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Cong L, et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science.
[点评]：张锋团队的开山之作。首次在哺乳动物细胞中证明了 Cas9 可以高效诱导 Indel 实现基因敲除。
[2] Shalem O, et al. (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science.
[点评]：建立了全基因组 CRISPR KO 筛选文库（GeCKO），使得高通量寻找功能基因和药物靶点成为可能。
[3] Frangoul H, et al. (2021). CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine.
[点评]：Casgevy 的临床试验结果。证明了通过 ex vivo 敲除 BCL11A 增强子，可以功能性治愈遗传性血液病。