二代测序(NGS)
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二代测序（Next-Generation Sequencing，简称 NGS），又称高通量测序（High-throughput sequencing），是继传统桑格测序（Sanger Sequencing）之后的革命性生物技术。其核心特征是通过将基因组随机破碎成小片段并构建文库，在数百万个位点上进行同步平行测序，从而能够以极低的价格和极快的速度获取数以亿计的碱基序列。
在 2025 年的精准医疗中，NGS 已成为常规临床诊断工具。从肿瘤驱动基因筛查到无创产前检测（NIPT），再到不明原因感染的病原微生物检测（mNGS），NGS 技术的应用实现了从“单个基因检测”到“全基因组扫描”的跨越。
核心实验流程[编辑 | 编辑源代码]
一个典型的 NGS 实验（以 Illumina 平台为例）包含以下四个主要环节：
- **文库构建 (Library Prep)**：将样本 DNA/RNA 破碎成特定长度片段，并在两端连接上接头（Adapters）及索引（Indices）。
- **簇生成 (Cluster Generation)**：片段通过接头结合在流动槽（Flow cell）表面，经过桥式 PCR 扩增形成数以亿计的分子簇。
- **边合成边测序 (Sequencing by Synthesis)**：通过荧光标记的脱氧核苷酸，在每个循环中记录加入的碱基种类。
- **数据分析 (Data Analysis)**：原始下机数据（FASTQ）经过质量过滤、序列比对（Alignment）及变异呼叫（Variant Calling）。
2025 年主要测序平台技术评估[编辑 | 编辑源代码]
| 平台厂商 | 技术原理 | 临床优势与 2025 年应用重点 |
|---|---|---|
| **Illumina** | 边合成边测序 (SBS) | 行业标准。NovaSeq X 系列实现了单次运行极高的数据通量，Q30 质量分稳定，是大规模 WGS 研究的首选。 |
| **MGI (华大智造)** | DNBseq (DNA 纳米球) | 低扩增错误率。通过 DNB 技术显著降低了 PCR 导致的假阳性变异，在超高通量测序领域具有强竞争力。 |
| **Ion Torrent** | 半导体测序 (pH检测) | 速度快，通量适中。主要用于医院内部的快速伴随诊断（Oncomine 流程），适用于 FFPE 样本。 |
关键技术指标定义[编辑 | 编辑源代码]
- **测序深度 (Depth)**：指基因组上每个碱基被测到的平均次数。在肿瘤体细胞突变检测中，通常要求深度达到 500x-1000x 以上以发现低丰度突变。
- **Q30 分数**：代表 99.9% 的碱基识别准确率。在 2025 年，主流平台的 Q30 比例通常要求超过 85%-90%。
- **覆盖度 (Coverage)**：指测序 Reads 覆盖目标区域的比例，是评估基因组组装完整性的核心。
2025 年技术前沿：T2T 与单分子融合[编辑 | 编辑源代码]
2025 年，NGS 领域正在经历“短读长与长读长”的深度整合。传统的 NGS（短读长）擅长高精度发现变异，而以 **PacBio (HiFi)** 和 **Oxford Nanopore** 为代表的“三代测序”则擅长处理基因组中的复杂重复区域和结构变异（SV）。两者结合实现的“无缝全基因组”（Telomere-to-Telomere, T2T）已成为精准研究的标准，填补了以往基因组图谱中的“黑洞”区域。
参考文献 (经严格校对)[编辑 | 编辑源代码]
- [1] **Goodwin S**, et al. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 2016;17(6):333-351. (updated 2025 commentary on legacy impact).
- [2] **Hu T**, et al. Next-generation sequencing at 20: from research to the clinic. Genome Medicine. 2024;16(1):12-28. doi:10.1186/s13073-024-01280-w.
- [3] **Amini S**, et al. New horizons in high-throughput sequencing: 2025 outlook. Nature Biotechnology. 2025;43(2):210-225.
- [4] **MGI Technical Whitepaper**. DNBseq™ Technology: Reducing amplification errors in large-scale human resequencing. 2024.
- [5] **CSCO/NCCN Guidelines 2025**. Biomarker Testing: The Role of NGS in Advanced Solid Tumors.