供体模板
供体模板（Donor Template），又称修复模板（Repair Template），是在基因组编辑中通过HDR (同源介导修复) 通路实现精准基因修饰（如Knock-in或点突变修复）所必需的外源 DNA 分子。它充当了基因组修复的“蓝图”。
供体模板的核心结构必须包含与基因组断裂位点两侧序列完全一致的同源臂 (Homology Arms, HA)，以及位于同源臂中间的预期插入序列（Payload）。根据载体形式，供体主要分为三大类：用于微小修饰的ssODN、用于大片段插入的双链 DNA (质粒/PCR产物)，以及临床级细胞治疗首选的AAV 病毒载体。设计不当的供体（如未突变 PAM 位点）会导致修复失败或效率极低。
选型策略：三大流派
选择哪种形式的供体，取决于插入序列的长度（Payload Size）和应用场景（细胞系 vs 临床治疗）。
| 类型 | 特征 | 最佳应用场景 |
|---|---|---|
| ssODN | 单链，合成快，毒性低，无随机整合风险。 | 点突变修复（SNV correction）、引入短标签（FLAG/HA）。限制是长度通常 < 200 nt。 |
| 双链 DNA (质粒) | 容量大，成本低。但对原代细胞毒性大（特别是裸露 DNA），且有随机整合风险。 | 细胞系构建（如 HEK293）。不推荐用于临床级原代 T 细胞或干细胞。 |
| AAV 病毒 | 单链 DNA 病毒。HDR 效率极高（高达 60-80%），毒性低。 | 临床级治疗（如 CAR-T 定点插入）。AAV6 血清型对 T 细胞和 HSC 具有天然的高亲和力。 |
设计铁律：防止 Cas9“回马枪”
供体设计中最致命的错误是忽略了 PAM 位点的突变。
- 问题： 如果供体仅仅修复了突变，而保留了原始的 sgRNA 识别序列和 PAM（NGG），那么当 HDR 发生后，Cas9 会识别刚刚修复好的序列并再次切割。
- 后果： 反复的“切割-修复”循环最终会导致 NHEJ 介入，在修复位点产生随机的 Indel，导致精准编辑失败。
- 解决方案： 在供体序列中引入同义突变 (Synonymous Mutation)。
1. 优先突变 PAM（如 NGG $\rightarrow$ NGT）。
2. 如果无法突变 PAM（如位于编码氨基酸的关键位点），则突变 Seed Region（靠近 PAM 的 8-10 bp）中的碱基。确保 Cas9 无法识别修复后的序列。
同源臂：多长才合适？
同源臂（Homology Arms, HA）是供体与基因组配对的“锚点”。其长度直接影响 HDR 的效率。
● ssODN： 推荐使用不对称设计。PAM 远端（Distal）建议 90 bp，近端（Proximal）建议 36 bp（总长 ~126 bp）。不对称设计能更快地与解离的 DNA 链结合。
● 双链 DNA (质粒/AAV)： 随着插入片段增大，HA 需要加长。一般建议左右臂各 500 bp - 800 bp。过短会导致同源重组无法启动，过长则增加载体构建难度且容易发生重组丢失。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Richardson CD, et al. (2016). Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.
[点评]：确立了 ssODN 的不对称设计原则，是目前学术界和工业界设计供体的金标准。
[2] Eyquem J, et al. (2017). Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature.
[点评]：经典案例。利用 AAV6 作为供体模板，将 CAR 基因精准敲入 T 细胞的 TRAC 位点，证明了 AAV 供体在细胞治疗中的优越性。
[3] Zhang JP, et al. (2017). Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology.
[点评]：提出在质粒供体两端加装 sgRNA 靶点，使其在细胞内线性化，能显著提高质粒介导的 Knock-in 效率。