CRISPRi
CRISPRi（CRISPR interference，CRISPR 干扰）是一种基于 CRISPR-Cas9 系统改造而来的基因表达抑制技术。它利用丧失了核酸酶切割活性的 dCas9（dead Cas9）蛋白，融合转录抑制结构域（如 KRAB），在 sgRNA 的引导下特异性结合到基因的启动子或转录起始位点 (TSS) 区域。
与传统的 Knock-out (KO) 技术不同，CRISPRi 不切断 DNA，不产生 DSB，因此不会引起基因组的永久性改变或 DNA 损伤反应（如 p53 激活）。与作用于 mRNA 水平的 RNA干扰 (RNAi) 相比，CRISPRi 直接在转录水平阻断 RNA 聚合酶的结合或延伸，具有脱靶率更低、抑制效果更强且可逆等优势，是目前研究基因功能和进行全基因组筛选的强力工具。
核心机制：路障与表观沉默
CRISPRi 的工作原理主要通过两种机制协同作用，形象地说是“物理占位”和“化学封锁”。
- 1. 物理位阻 (Steric Hindrance)： dCas9 蛋白（通过突变 D10A 和 H840A 使其失去切割活性）紧紧结合在 DNA 上。当它结合在转录起始位点（TSS）或编码区时，就像路障一样，物理阻挡 RNA聚合酶 的结合或延伸。
- 2. 表观遗传沉默 (Epigenetic Silencing)： 仅靠位阻效率较低（~60%）。为了提高效率，通常将 dCas9 融合 KRAB (Krüppel-associated box) 结构域。KRAB 能招募 Kap1、HP1 等异染色质蛋白，诱导组蛋白甲基化（如 H3K9me3），将靶区域的染色质压缩成异染色质，从而实现 >95% 的强效沉默。
- 3. dCas9-KRAB-MeCP2： 为了进一步增强效果，新一代 CRISPRi 系统融合了 KRAB 和 MeCP2 两个抑制域，效果更强且更持久。
技术对比：为何选择 CRISPRi？
在基因功能缺失研究中，CRISPRi 填补了 RNAi（敲低不彻底、脱靶）和 CRISPR-KO（不可逆、DNA损伤）之间的空白。
| 特性 | RNAi (siRNA/shRNA) | CRISPR-Cas9 (KO) | CRISPRi |
|---|---|---|---|
| 作用靶点 | mRNA (胞浆) | DNA (基因组) | DNA (转录水平) |
| 结果 | Knock-down (部分) | Knock-out (完全) | Knock-down (强效) |
| DNA损伤 | 无 | DSB (激活 p53) | 无 (DSB-free) |
| 脱靶效应 | 高 (microRNA 样效应) | 中等 (Indel) | 极低 |
| 可逆性 | 是 | 否 (永久) | 是 (去诱导即恢复) |
应用场景：从 LncRNA 到 代谢流
- 非编码 RNA 研究： 研究 LncRNA 的功能非常困难，因为 KO 产生的微小 Indel 往往不影响 LncRNA 的功能（没有 ORF），而 RNAi 难以进入细胞核降解核内 LncRNA。CRISPRi 直接在 TSS 处阻断转录，是研究 LncRNA 的金标准。
- 合成生物学与代谢工程： 在细菌或酵母中，利用 CRISPRi 可以精细调节代谢通路中多个酶的表达水平（Multiplexing），从而平衡代谢流，提高产物滴度，而不必敲除必须基因。
- 全基因组筛选： 相比 CRISPR-KO 筛选，CRISPRi 筛选产生的噪音更小，且不会造成大量细胞因 DNA 损伤而死亡，特别适合对必需基因 (Essential Genes) 进行亚致死水平的功能分析。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Gilbert LA, et al. (2013). CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell.
[点评]：CRISPRi 技术的奠基之作。Jonathan Weissman 团队首次展示了 dCas9-KRAB 可以高效、特异地抑制哺乳动物细胞的基因表达。
[2] Qi LS, et al. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell.
[点评]：同时期的另一篇重要论文，重点阐述了 dCas9 在原核系统中的抑制作用，展示了其在合成生物学中的潜力。
[3] Horlbeck MA, et al. (2016). Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife.
[点评]：优化了 sgRNA 的设计规则（如靶向 TSS 下游 50-100bp 最佳），并发布了用于全基因组 CRISPRi/a 筛选的文库（hCRISPRi-v2）。