DCas9
dCas9（dead Cas9，失活 Cas9）是 CRISPR-Cas9 基因编辑系统的突变衍生物，常被誉为基因组工程的“可编程锚点”。它是通过对天然 Cas9 核酸酶的两个催化结构域进行点突变（D10A 和 H840A）而获得的。
这种突变使得 dCas9 完全丧失了内切酶活性，即无法切割 DNA 双链，但它仍保留了在 sgRNA 引导下特异性识别并紧密结合目标 DNA 序列的能力。利用这一特性，dCas9 被改造为多种功能强大的工具：通过融合转录调控因子，它实现了 CRISPRi（干扰）和 CRISPRa（激活）；通过融合脱氨酶，它催生了不依赖 DSB 的 碱基编辑 (Base Editing) 技术；通过融合荧光蛋白，它成为活细胞基因组成像的探针。
分子机制：剪刀变路障
dCas9 的本质是将“基因剪刀”转变为“基因路障”或“基因运载体”。
- 1. 双重突变致失活： 野生型 SpCas9 拥有两个切割结构域：RuvC 和 HNH。科学家将 RuvC 结构域的第 10 位天冬氨酸突变为丙氨酸 (D10A)，将 HNH 结构域的第 840 位组氨酸突变为丙氨酸 (H840A)。这两个位点是负责水解磷酸二酯键的关键残基。
- 2. 保留定位功能： 尽管失去了切割能力，dCas9 蛋白的空间构象仍能与 sgRNA 结合，并在 sgRNA 的引导下，通过 PAM 序列识别机制，精准地“坐”在靶向 DNA 序列上。
- 3. 模块化平台： 这种“只结合不切割”的特性，使 dCas9 成为了一个完美的模块化平台。通过在其 N 端或 C 端融合不同的功能蛋白效应子（Effectors），可以赋予它任意想要的功能（如转录激活、抑制、甲基化修饰、荧光标记等）。
技术衍化：dCas9 的多面角色
dCas9 的出现极大地扩展了 CRISPR 技术的应用边界，使其从单纯的“基因编辑”走向了更广泛的“基因组工程”。
| 应用领域 | 融合元件 | 功能描述 |
|---|---|---|
| 干扰 (CRISPRi) | KRAB | 阻断转录起始或招募异染色质蛋白，抑制基因表达。 |
| 激活 (CRISPRa) | VP64 / VPR | 招募转录因子和 RNA 聚合酶，强效激活内源基因。 |
| 碱基编辑 (BE) | APOBEC / TadA | 在不切断 DNA 的情况下，实现 C→T 或 A→G 的单碱基转换。 |
| 表观编辑 | DNMT3A / p300 | 定点改变 DNA 甲基化或组蛋白乙酰化状态，调控细胞记忆。 |
优势与挑战
- 优势 - 安全性： dCas9 最大的优势在于不产生 DNA 双链断裂 (DSB)。这避免了 NHEJ 修复带来的不可控插入缺失，也极大降低了基因组重排和 p53 介导的细胞毒性风险。
- 优势 - 可逆性： 许多 dCas9 系统（尤其是 CRISPRi/a）的作用是暂时的或可诱导的，不像 Cas9 切割那样造成永久性的序列改变。
- 挑战 - 递送困难： dCas9 蛋白本身分子量大（~160kDa），若再融合 KRAB 或 VPR 等效应子，基因尺寸往往超过 AAV 病毒载体的包装极限，使得体内递送成为挑战。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Qi LS, et al. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell.
[点评]：dCas9 的开山之作。斯坦福大学 Qi Lei 等人首次报道了利用 dCas9 结合 sgRNA 在大肠杆菌和哺乳动物细胞中实现转录干扰（CRISPRi）。
[2] Komor AC, et al. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature.
[点评]：David Liu 实验室利用 dCas9（及 Cas9n）融合胞苷脱氨酶，开发了第一代碱基编辑器（CBE），开启了不依赖 DSB 的精准编辑时代。
[3] Chen B, et al. (2013). Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell.
[点评]：首次展示了 dCas9-EGFP 融合蛋白可以作为活细胞内的基因组探针，实时观察端粒和特定基因位点的动态变化。