NHEJ
非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）是真核细胞修复 DNA 双链断裂 (DSB) 的主要途径之一。与依赖模板的同源重组修复 (HDR) 不同，NHEJ 不需要同源序列作为模板，而是直接将断裂的 DNA 末端“强行”连接起来。
NHEJ 可以在细胞周期的任何阶段发生（主要在 G1 期），具有修复速度快的优势，但由于经常涉及末端核苷酸的切除或添加，它被认为是一种“易错” (Error-prone) 的修复机制。这种“易错”特性正是 CRISPR-Cas9 技术实现基因敲除（Knockout）的生物学基础——通过引入随机的Indel（插入缺失）导致移码突变，从而破坏基因功能。此外，NHEJ 也是免疫系统中 V(D)J重排 产生抗体多样性的关键机制。
分子机制：四步修复法
NHEJ 是一套高效的应急响应系统，其核心逻辑是“先结合，再修整，最后连接”。
- 1. 识别与结合 (Recognition)： DNA 双链断裂后，环状的 Ku70/Ku80 异二聚体 迅速滑动到 DNA 末端并紧密结合，防止断端被核酸外切酶降解。Ku 复合物充当了后续蛋白的“停机坪”。
- 2. 桥接与激活 (Synapsis)： Ku 复合物招募 DNA-PKcs（DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基）。两个断端的 DNA-PKcs 相互作用，将断裂的 DNA 拉近，并激活自身的激酶活性。
- 3. 末端加工 (End Processing)： 如果断端不平整（如存在悬垂），核酸酶 Artemis 会在 DNA-PKcs 的磷酸化调节下，对末端进行修剪（切除或填补），使其变成平末端（Blunt ends）。注：这一步是导致碱基丢失的主要原因。
- 4. 连接 (Ligation)： XRCC4 和 XLF 形成支架，招募并稳定 DNA 连接酶 IV (Ligase IV)，最终完成磷酸二酯键的连接。
基因编辑：利用错误创造功能
在 CRISPR-Cas9 应用中，NHEJ 是实现基因敲除（Knockout）的“幕后推手”。
| 过程 | 描述 |
|---|---|
| 定点切割 | Cas9 在 sgRNA 引导下切断 DNA，产生平末端 DSB。 |
| 反复切割 | 若 NHEJ 完美修复了断裂，Cas9 会识别原序列再次切割。 |
| 引入Indel | 一旦 NHEJ 在修复中发生了“错误”（如删除了 1bp），破坏了 Cas9 的靶位点序列，切割循环停止。此时，基因组中留下了一个永久的 Indel。 |
| 移码突变 | Indel 导致开放阅读框（ORF）移位，产生提前终止密码子，实现 Gene Knockout。 |
竞争关系：NHEJ vs HDR
在基因编辑（特别是 Knock-in）中，我们需要抑制 NHEJ 以促进 HDR：
● 优势： NHEJ 是细胞的“默认”修复模式，反应极快（30分钟内），且在不分裂细胞（G0/G1期）中也能工作。这使得它在大多数细胞类型中占据主导地位。
● 劣势： 它是 HDR 的主要竞争对手。为了实现精准的基因敲入（Knock-in），科学家常通过药物（如 SCR7 抑制 Ligase IV）或遗传手段抑制 NHEJ 途径，从而迫使细胞选择 HDR 通路。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Lieber MR. (2010). The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end joining pathway. Annual Review of Biochemistry.
[点评]：NHEJ 领域的权威综述。详细解析了 Ku、DNA-PKcs 和 Artemis 在 V(D)J 重排和通用 DNA 修复中的分子协同机制。
[2] Doudna JA, Charpentier E. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science.
[点评]：阐述了 CRISPR 技术如何利用细胞内源性的 NHEJ 途径来实现高效的基因组编辑。
[3] Maruyama T, et al. (2015). Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology.
[点评]：探讨了通过抑制 NHEJ（如使用 SCR7）来提高 HDR 介导的精准基因敲入效率的策略。