冷冻电镜
冷冻电镜（Cryo-electron Microscopy，简称 Cryo-EM）是一种在低温下使用透射电子显微镜观察样品的结构生物学技术。它通过将生物大分子（如蛋白质、病毒、复合物）在液乙烷中急速冷冻，使其被包裹在玻璃态冰 (Vitreous Ice) 中，从而保持其天然的水合状态和活性构象。
与传统的 X射线晶体学 相比，Cryo-EM 不需要将样品结晶，彻底解决了长期困扰结构生物学的“结晶难”瓶颈。随着直接电子探测器（DED）和图像处理算法的突破，Cryo-EM 引发了著名的“分辨率革命 (Resolution Revolution)”，目前已能解析原子分辨率（<1.2 Å）的精细结构，是现代药物研发（SBDD）不可或缺的利器。2017 年诺贝尔化学奖授予了该领域的三位奠基人。
核心流程：从水溶液到 3D 模型
Cryo-EM 的成功依赖于三个关键步骤的完美配合：冷冻、成像与重构。
- 1. 玻璃化冷冻 (Vitrification)： 将样品滴在金属网格（Grid）上，用滤纸吸走多余液体形成超薄液膜，然后迅速投入液乙烷中。这种极速冷却防止了水分子结晶形成冰晶（冰晶会破坏蛋白结构），而是形成类似玻璃的非晶态冰，将蛋白“冻龄”在天然状态。
- 2. 低剂量成像 (Low-dose Imaging)： 电子束对生物样品有强烈的辐射损伤。为了保护样品，Cryo-EM 使用极低的电子剂量进行拍摄。这导致原始图像信噪比极低，肉眼几乎看不清颗粒，类似于在暴风雪中看人。
- 3. 图像重构 (Image Processing)： 依靠强大的算法（如 RELION, CryoSPARC），从成千上万张模糊的 2D 投影图中识别出蛋白质颗粒，通过对齐、分类和平均，去除噪声，最终反算出高分辨率的 3D 密度图。
三大技术的巅峰对决
在结构生物学领域，Cryo-EM 以后来居上的姿态，弥补了 X-ray 和 NMR 的短板。
| 特性 | X射线晶体学 (X-ray) | 核磁共振 (NMR) | 冷冻电镜 (Cryo-EM) |
|---|---|---|---|
| 样品状态 | 必须结晶 (最大瓶颈) | 溶液 | 溶液 (冷冻) |
| 分子量限制 | 无限制 | 小分子 (<30-50 kDa) | 大分子 (>50 kDa, 上不封顶) |
| 样品用量 | 多 (mg级) | 多 (mg级) | 极少 (ug级) |
| 动态信息 | 静态快照 | 动态极好 | 多构象 (可分类处理) |
杀手级应用：膜蛋白与病毒
- 膜蛋白 (Membrane Proteins)： 离子通道、GPCR 等膜蛋白极难结晶，是 X-ray 的噩梦。Cryo-EM 结合 Nanodisc 技术，可以在模拟天然膜环境的状态下解析其结构，极大加速了新药开发。
- 巨型复合物： 如核糖体、剪接体、病毒衣壳等超大分子机器，是 Cryo-EM 的天然主场。
- 临床快速响应： 在 COVID-19 疫情中，科学家利用 Cryo-EM 在数周内解析了 SARS-CoV-2 刺突蛋白 (Spike) 的结构，为疫苗设计提供了关键蓝图。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Dubochet J, et al. (1988). Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Review of Biophysics.
[点评]：奠基之作。Jacques Dubochet 建立了水溶液玻璃化冷冻的方法，这是 Cryo-EM 诞生的物理基础。
[2] Kühlbrandt W. (2014). The resolution revolution. Science.
[点评]：著名综述。宣告了由于直接电子探测器（DED）的发明，电镜技术进入了原子分辨率时代。
[3] Liao M, Agard DA, Cheng Y. (2013). Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature.
[点评]：里程碑论文。程亦凡团队首次利用 Cryo-EM 解析了膜蛋白 TRPV1 的原子结构（3.4 Å），打破了“电镜只能看轮廓”的固有印象。