SgRNA
sgRNA（Single Guide RNA，单向导 RNA）是 CRISPR-Cas9 基因编辑系统中的核心导航元件。它是科学家基于天然 CRISPR 系统中的 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（反式激活 crRNA）进行人工融合改造而成的嵌合 RNA 分子。
sgRNA 将天然的双 RNA 结构简化为一条单链 RNA，其 5' 端包含一段约 20nt 的间隔序列 (Spacer)，用于通过碱基互补配对特异性识别目标 DNA；其 3' 端则形成了复杂的二级结构（骨架 Scaffold），用于招募并锚定 Cas9 核酸酶。sgRNA 的发明极大简化了基因编辑的操作流程，只需一段 RNA 即可引导 Cas9 到达基因组的任意位置，实现了真正的“可编程”基因编辑。
分子解剖：从双链到单链
sgRNA 的设计是 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 团队的神来之笔，它将天然复杂的细菌免疫组件简化为了实验室易用的工具。
- 1. 间隔序列 (Spacer, 5'端)： 位于 sgRNA 的最前端，通常为 20 个核苷酸。这是 sgRNA 中唯一需要根据靶基因进行“编程”的部分。它通过碱基互补配对与 DNA 结合。注意，Spacer 的选择必须紧邻基因组上的 PAM (NGG) 序列。
- 2. 种子序列 (Seed Sequence)： Spacer 中靠近 PAM 的 8-12 个碱基被称为“种子序列”。这一区域的配对严谨性最高，如果种子序列发生错配，Cas9 通常无法结合或切割，这是决定脱靶效应 (Off-target) 的关键区域。
- 3. 骨架 (Scaffold, 3'端)： 由天然的 crRNA 重复序列和 tracrRNA 通过人工设计的“四环 (Tetraloop)”连接而成。这部分形成特定的发夹结构（Hairpin），如同把手一样被 Cas9 蛋白紧紧抓住，激活 Cas9 的酶活性。
技术演进：从 sgRNA 到 pegRNA
随着基因编辑技术的发展，sgRNA 的结构也在不断进化，以适应更复杂的编辑需求。
| 类型 | 结构特征 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 标准 sgRNA | 20nt Spacer + Scaffold | Knock-out, CRISPRi, CRISPRa (通用) |
| tru-gRNA | 缩短的 Spacer (17-18nt) | 降低脱靶效应 (减少对错配的容忍度) |
| pegRNA | 3'端带有 RT 模板和 PBS | 引导编辑 (Prime Editing)：可实现任意碱基的精准替换。 |
| Chem-mod sgRNA | 两端含 2'-O-methyl 等修饰 | 临床治疗 (防止在细胞内被 RNA 酶降解，提高半衰期) |
设计原则与质控
- GC 含量： 理想的 GC 含量通常在 40%-60% 之间。GC 含量过高可能导致二级结构复杂，过低则结合不稳。
- Poly-T 规避： 这种序列应避免出现连续的 4 个 T (TTTT)，因为这会作为 RNA 聚合酶 III (如 U6 启动子) 的转录终止信号，导致 sgRNA 提前截断。
- 特异性评分： 使用算法（如 MIT score, CFD score）预测脱靶风险，优先选择与其他基因组位点错配数多（>3个）的序列。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Jinek M, et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science.
[点评]：获得诺贝尔奖的奠基之作。该论文首次展示了将 crRNA 和 tracrRNA 融合为单分子 sgRNA 的可能性，证明了其足以引导 Cas9 切割 DNA。
[2] Doench JG, et al. (2016). Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology.
[点评]：Broad 研究所建立了广泛使用的 sgRNA 设计规则（Rule Set 2），极大提高了 sgRNA 的切割效率预测准确性。
[3] Anzalone AV, et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature.
[点评]：引入了 pegRNA (prime editing guide RNA) 的概念，赋予了 sgRNA 携带“修改模板”的新功能。