Knock-down
基因敲低（Gene Knock-down，简称 KD）是一种通过干扰基因的转录或转录后过程，从而显著降低（而非完全消除）特定基因表达水平的技术。与永久性改变基因组 DNA 序列的 Knock-out (KO) 不同，KD 通常作用于 mRNA 水平，通过促进 mRNA 降解或阻滞其翻译来发挥作用。
实现 KD 的主流技术包括 RNA干扰 (RNAi)（如 siRNA、shRNA）、反义寡核苷酸 (ASO) 以及基于 CRISPR 的转录抑制技术 (CRISPRi)。由于 KD 具有可逆性和剂量可调性，它不仅是基础研究中通过“功能缺失”策略研究基因功能的利器，更是现代核酸药物（如 Inclisiran）治疗高血脂、罕见病的核心原理。
核心机制：劫持 RISC 复合物
虽然 KD 有多种实现方式，但最经典、应用最广的是基于 RNA 干扰 (RNAi) 的机制。这是一个真核细胞天然存在的、用于抵御病毒 RNA 的防御系统。
- 1. 触发 (Trigger)： 双链 RNA（dsRNA）或前体 miRNA 进入细胞。对于人工 KD，这通常是化学合成的 siRNA 或质粒表达的 shRNA。
- 2. 加工 (Processing)： 长链 dsRNA 被 Dicer 酶切成约 21-23 nt 的短片段（siRNA）。如果是 shRNA，则需先转运出核并被切割。
- 3. 装载 (Loading)： siRNA 被装载到 RISC（RNA 诱导沉默复合物）上。RISC 中的核心蛋白 Argonaute (Ago2) 会丢弃 siRNA 的“正义链”（Passenger strand），只保留“反义链”（Guide strand）。
- 4. 降解 (Slicing)： RISC 在反义链的引导下，特异性结合互补的靶 mRNA，并由 Ago2 切割 mRNA。失去完整性的 mRNA 随后被细胞内的核酸外切酶彻底降解，导致蛋白无法翻译。
工具选型：瞬时还是持久？
实验中选择哪种 KD 工具，取决于实验目的（短期筛选 vs 长期表型）和细胞类型（易转染 vs 难转染）。
| 工具 | 本质 | 优缺点 |
|---|---|---|
| siRNA | 小干扰 RNA (双链 RNA 模拟物) |
优点： 操作简单，直接转染，起效快（24-48h）。 缺点： 瞬时效应（持续 3-7 天），随细胞分裂而稀释；难转染细胞效率低。 |
| shRNA | 短发夹 RNA (DNA 载体表达) |
优点： 可包装进慢病毒，实现难转染细胞的感染；整合入基因组，实现永久 KD（构建稳转株）。 缺点： 需构建载体，生效较慢。 |
| CRISPRi | dCas9-KRAB (转录抑制因子) |
优点： 无脱靶降解（不切断 mRNA）；可同时抑制多个基因（Multiplexing）。 缺点： 需表达庞大的 dCas9 蛋白，且需设计 sgRNA 靶向 TSS 区域。 |
临床应用：小核酸药物的崛起
KD 技术已从实验室走向临床，诞生了小核酸药物（siRNA/ASO Drug）这一千亿级赛道。其核心突破在于递送系统。
● GalNAc 偶联技术： 将 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接到 siRNA 末端。GalNAc 能特异性结合肝细胞表面的 ASGPR 受体，使 siRNA 被高效内吞入肝。代表药物 Inclisiran (Leqvio)，仅需半年注射一次，即可长效 Knock-down 肝脏中的 PCSK9 蛋白，强效降脂。
● LNP 脂质纳米粒： 类似 mRNA 疫苗的包装，将 siRNA 包裹在脂质体中。代表药物 Onpattro（治疗 hATTR 淀粉样变性），是 FDA 批准的首款 siRNA 药物。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Fire A, et al. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature.
[点评]：诺贝尔奖奠基之作。首次发现了 RNAi 现象，开启了基因敲低技术的新纪元。
[2] Elbashir SM, et al. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.
[点评]：Tuschl 团队证明了合成的 21nt siRNA 可以绕过免疫反应，直接在哺乳动物细胞中引发 RNAi，确立了 siRNA 作为实验工具的地位。
[3] Gilbert LA, et al. (2013). CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell.
[点评]：CRISPRi 技术的开创性论文。展示了利用失活的 dCas9 融合转录抑制域（KRAB），可以在 DNA 水平上实现可逆的基因敲低。