HDR
同源介导修复（Homology-Directed Repair，HDR）是基因组编辑领域中实现精准编辑（Precise Editing）的核心策略。它利用细胞内源性的HR (同源重组) 通路，在 CRISPR-Cas9 等核酸酶产生 DNA 双链断裂（DSB）后，通过人为提供一段含有同源臂的外源 DNA（供体/Donor），将特定的序列“拷贝粘贴”到基因组中。
与导致随机破坏的 NHEJ 不同，HDR 可以实现单碱基的精确修正（如修复遗传病突变）或大片段外源基因的定点插入（Knock-in，如 CAR-T 细胞中 CAR 的插入）。然而，由于 HDR 仅在细胞周期的 S/G2 期 活跃，且面临 NHEJ 的激烈竞争，其低效率一直是制约基因治疗临床应用的主要瓶颈。
供体设计：同源臂的艺术
HDR 的成功与否，关键在于“供体模板”（Donor Template）的设计。供体必须包含与断裂位点两侧序列完全匹配的同源臂 (Homology Arms, HA)，以及中间希望插入的序列。
| 供体类型 | 同源臂长度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| ssODN | 不对称 (36bp / 91bp) 或对称 (60bp) | 点突变修复、引入标签（如 FLAG, HA）、引入酶切位点。通常用于 < 50bp 的插入。 |
| 双链质粒 (dsDNA) | 较长 (500bp - 1kb) | 大片段插入（如 GFP, CAR 基因）。效率较低，且有随机整合风险。 |
| AAV 病毒 | 300bp - 800bp | 体内/体外高效 Knock-in。利用 AAV 的单链 DNA 特性，HDR 效率远高于质粒。常用于 CAR-T 制备。 |
效率瓶颈：与 NHEJ 的博弈
在细胞中，HDR 和 NHEJ 是竞争关系。NHEJ 是“默认设置”，反应极快且全周期发生；HDR 是“高级设置”，仅在 S/G2 期发生。为了提高 HDR 效率，必须打破这种平衡。
- 策略 1：抑制 NHEJ。 使用小分子药物（如 SCR7 抑制 Ligase IV，Nu7441 抑制 DNA-PKcs）或降解 Ku70/80 蛋白。
- 策略 2：激活/招募 HDR 因子。 将 Cas9 与 CtIP 或 Geminin（使 Cas9 仅在 S/G2 期降解）融合，或使用 RS-1 激活 RAD51。
- 策略 3：供体修饰。 使用硫代修饰（Phosphorothioate）保护 ssODN 末端不被降解；或在 dsDNA 供体两端加装 Cas9 切割位点（MMEJ-assisted HDR），使其在细胞内线性化。
- 策略 4：冷休克 (Cold Shock)。 暂时降低培养温度（如 32°C），可显著增加 HDR 效率（机制可能涉及减缓细胞周期和增加酶稳定性）。
局限与替代：非分裂细胞的挑战
HDR 最大的死穴在于它无法在非分裂细胞（如神经元、心肌细胞、视网膜细胞）中工作，因为这些细胞停滞在 G0 期，缺乏 HDR 所需的酶（如 CtIP, BRCA2）。
替代方案：
● HITI (Homology-Independent Targeted Integration)： 聪明地利用 NHEJ 通路实现定点插入。通过在供体两侧设计与基因组相同的 Cas9 切割位点，如果 NHEJ 正确连接则保留，错误连接则被再次切割，直到插入成功。
● Prime Editing (先导编辑)： 不需要 DSB 和外源供体，直接利用逆转录酶在基因组局部“写入”新序列，是目前修正点突变的最强工具。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Paquet D, et al. (2016). Efficient introduction of specific alleles into the human genome. Nature.
[点评]：经典方法学论文。系统优化了 ssODN 的设计（不对称同源臂）和距离切口的最佳位置（<10bp），定义了 HDR 实验的金标准。
[2] Maruyama T, et al. (2015). Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology.
[点评]：首次提出使用 SCR7 抑制 Ligase IV 从而抑制 NHEJ，使 HDR 效率提高数倍的策略。
[3] Suzuki K, et al. (2016). In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature.
[点评]：开发了 HITI 技术，解决了在非分裂细胞（如视网膜色素变性小鼠模型）中进行基因敲入的难题，绕过了对 HDR 的依赖。