FluoroSpot
FluoroSpot（Fluorescence-Linked ImmunoSpot，荧光免疫斑点技术）是基于 ELISPOT 发展而来的新一代单细胞水平免疫检测技术。与传统 ELISPOT 使用酶底物显色不同，FluoroSpot 利用不同波长的荧光标记抗体，能够在同一个微孔内同时检测单个细胞分泌的两种或多种不同的细胞因子（如 IFN-γ 和 IL-2）。这一技术突破使得研究人员能够精准识别具有多功能性 (Polyfunctionality) 的免疫细胞，从而更全面地评估疫苗效力、感染免疫状态及肿瘤免疫微环境。
原理：单细胞的“交通信号灯”
FluoroSpot 的基本流程（包被、培养、捕获）与 ELISPOT 类似，但其检测环节引入了“光谱分离”的概念：
- 双重捕获： 膜上同时包被了针对两种不同细胞因子（如 IFN-γ 和 IL-2）的抗体。
- 荧光标记： 洗去细胞后，加入两种标记了不同荧光基团的二抗。例如：抗 IFN-γ 标记绿色荧光（FITC），抗 IL-2 标记红色荧光（Cy3）。
- 共表达识别：
● 只分泌 IFN-γ 的细胞 = 绿色斑点
● 只分泌 IL-2 的细胞 = 红色斑点
● 同时分泌两种因子的细胞 = 空间位置重合的黄色/橙色斑点（Double Positive）。
技术代差：FluoroSpot vs ELISPOT
为什么酶联显色做不到“共表达”？
传统 ELISPOT 使用酶催化底物产生有色沉淀。如果在一个孔里同时测两种因子，沉淀颜色会混合（如蓝+红=紫），边缘模糊，机器极难分辨。而荧光信号是光，可以通过滤光片完美分离，互不干扰。
| 特性 | 传统 ELISPOT | FluoroSpot |
|---|---|---|
| 检测指标数 | 通常 1 个 (单色) | 2 - 4 个 (多色) |
| 共表达分析 | 非常困难 | 精准量化 |
| 样本用量 | 每个指标需单独一孔 | 一孔测多指标 (节省样本) |
| 动态范围 | 斑点过多会连成片 (Over-saturation) | 荧光信号线性范围更广 |
核心应用：寻找“超级士兵”
多功能 T 细胞 (Polyfunctional T cells)
在疫苗评估中，“质量”重于“数量”。研究发现，能同时分泌 IFN-γ（杀伤）、IL-2（增殖）和 TNF-α（炎症）的“多功能 T 细胞”，比只能分泌一种因子的细胞具有更强的保护力。FluoroSpot 是目前检测这类“超级士兵”最灵敏的方法，远超流式细胞术（因为流式需要破膜，会损失部分信号，且对极低频细胞检测能力弱）。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Gazagne A, et al. (2003). A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods.
[点评]：FluoroSpot 技术的奠基性文献，首次描述了利用荧光检测双细胞因子的方法。
[2] Janetzki S, et al. (2014). Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays (MIATA). Nature Protocols.
[点评]：制定了 ELISPOT 和 FluoroSpot 实验操作及数据分析的国际标准化指南。
[3] Mao X, et al. (2021). FluoroSpot assay: A versatile tool for characterizing immune responses. Frontiers in Immunology.
[点评]：综述文章，详细介绍了该技术在 COVID-19 疫苗和癌症免疫治疗监测中的最新应用。