ELISPOT
ELISPOT（Enzyme-Linked ImmunoSpot，酶联免疫斑点技术）是一种结合了 ELISA（酶联免疫吸附）的高特异性与细胞培养技术的高灵敏度，用于在单细胞水平上定量检测分泌特定蛋白（如细胞因子、抗体）细胞频率的免疫学方法。其核心原理是利用特异性抗体捕获培养中的活细胞分泌的微量细胞因子，通过显色反应在膜上形成肉眼可见的“斑点”（Spot）。每一个斑点代表一个分泌细胞。由于其灵敏度比传统 ELISA 高 10-200 倍，ELISPOT 已成为结核病诊断（T-SPOT）、疫苗临床试验及肿瘤免疫监测的“金标准”。
实验原理：原位捕获
ELISPOT 的过程可以想象为给每一个正在分泌细胞因子的细胞“拍照留念”。其关键在于使用不溶性底物，使信号固定在原位：
- 包被 (Coating)： 在 PVDF 膜板上预包被高浓度的特异性单克隆抗体（如抗 IFN-γ）。
- 细胞培养 (Incubation)： 加入待测细胞（如 PBMC）和特异性抗原刺激物。细胞在受刺激活化后，开始向外分泌细胞因子。
- 原位捕获 (Capture)： 分泌出的细胞因子一出细胞膜，就被底部的抗体“抓”住，固定在细胞周围。
- 显色 (Development)： 移去细胞，加入酶标二抗和沉淀型底物（如 BCIP/NBT）。底物在酶的作用下形成不溶性沉淀，在膜上留下清晰的斑点。
三大免疫检测技术对比
| 特性 | ELISPOT | ELISA | 胞内流式 (ICS) |
|---|---|---|---|
| 测量内容 | 分泌细胞的频率 (功能性 T 细胞数量) |
上清液总浓度 (无法区分细胞数量) |
细胞频率 + 表型 (如 CD4+/CD8+) |
| 灵敏度 | 极高 (1/105) | 中等 | 较低 (0.01% 以上) |
| 样本状态 | 活细胞 (必须) | 液体 (血清/上清) | 固定/破膜细胞 |
| 主要优势 | 检测痕量抗原特异性细胞 | 简单、快速、高通量 | 多参数分析 |
临床与科研应用
1. 结核诊断 (IGRA)
目前临床最广泛的应用是 T-SPOT.TB。通过检测患者 T 细胞受到结核特异性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激后分泌 IFN-γ 的情况，来判断是否存在结核分枝杆菌潜伏感染。相比 PPD 皮试，它不受卡介苗干扰，特异性极高。
2. 疫苗评估与免疫监测
在 COVID-19 和肿瘤疫苗（如新抗原疫苗）临床试验中，ELISPOT 是评估细胞免疫应答（T 细胞反应）的核心指标。它能回答“接种疫苗后，体内有多少个 T 细胞能识别病毒/肿瘤”这一关键问题。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Czerkinsky CC, et al. (1983). A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods.
[点评]：ELISPOT 技术的开山之作，最初用于检测分泌抗体的 B 细胞，后被广泛用于 T 细胞检测。
[2] Lalvani A, et al. (2001). Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine.
[点评]：确立了基于 ELISPOT 的 IGRA 技术（T-SPOT）在结核病诊断中的临床地位。
[3] Slota, M., et al. (2011). ELISpot for measuring human immune responses to vaccines. Expert Review of Vaccines.
[点评]：系统综述了 ELISPOT 在现代疫苗研发中作为免疫原性评价工具的重要性。