FISH
FISH（Fluorescence In Situ Hybridization，荧光原位杂交）是一种利用荧光标记的特异性 核酸探针，在细胞或组织原位检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子细胞遗传学技术。其核心原理基于 碱基互补配对，通过荧光显微镜直接观察染色体结构异常或数量变异。作为临床诊断的“金标准”，FISH 在检测 HER2 扩增、ALK 易位、MET 拷贝数变异以及血液肿瘤的染色体畸变中具有不可替代的地位。相比于 NGS，FISH 能够提供单细胞水平的空间分布信息，是评估 GCN（基因拷贝数）及 多体性 的权威手段。
技术流程与生化步骤
FISH 的实验操作要求极高的精确度，通过物理与化学手段将微观的遗传信息转化为宏观的荧光信号：
- 变性 (Denaturation)： 使用高温或化学试剂将目标 DNA 双链和标记探针同时变性为单链，暴露结合位点。
- 杂交 (Hybridization)： 在最适温度下，探针与细胞核内的互补序列进行退火配对。
- 洗脱 (Washing)： 移除未结合或非特异性结合的背景探针，这是保证 信噪比 的关键步骤。
- 复染与检测： 使用 DAPI 对细胞核进行蓝色荧光背景复染，在荧光显微镜下计数彩色荧光信号点（Dots）。
临床景观：常见探针设计与判读模式
针对不同的遗传学变异类型，FISH 采用了多种巧妙的探针组合方式：
| 探针类型 | 设计逻辑 | 典型临床应用 |
|---|---|---|
| 双色双位点 (LSI/CEP) | 靶基因探针 + 染色体着丝粒参考探针。 | 检测 HER2 或 MET 扩增，计算 Ratio 以区分 局灶性扩增 与多体性。 |
| 分离探针 (Break-apart) | 靶基因两侧分别标以红/绿荧光。 | 检测 ALK 或 ROS1 易位。红绿信号分离即代表发生重排。 |
| 双融合探针 (Dual-fusion) | 两个易位基因分别标以不同荧光。 | 检测 BCR-ABL（费城染色体）。重叠产生的黄色融合信号是易位的确证。 |
技术比较：为何 FISH 依然不可替代
- 空间特异性： 相比于 NGS 或 qPCR 的“均质化”检测，FISH 能在组织切片上直接观察 异质性。例如在乳腺癌中，FISH 能识别仅存在于局部细胞群中的 HER2 扩增。
- 多体性鉴别： 只有 FISH 能通过靶基因/着丝粒比值 (Ratio) 精准剔除由于整条染色体增多导致的 GCN 假性升高。
- 检测周期与成本： 对于已知位点的易位（如 ALK），FISH 通常比 NGS 更快捷且更具成本效益。
- 主要局限： 吞吐量较低，属于“已知靶点”检测，无法像 NGS 那样发现未知的融合伴侣基因。
关键关联概念
- GCN： FISH 评估的核心定量指标。
- 局灶性扩增： FISH 信号表现为密集的信号簇（Clusters）。
- 分离探针： 鉴定基因重排的特异性工具。
- HER2： FISH 临床应用最广、标准化程度最高的靶点。
学术参考文献与权威点评
[1] Wolff AC, et al. (2018). Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: ASCO/CAP Clinical Practice Guideline Focus Update. JCO.
[学术点评]：该指南详尽定义了 FISH 在 HER2 判读中的全球金标准，特别是对 ISH 结果各组分类的临床意义。
[2] Gall JG, Pardue ML. (1969). Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. PNAS.
[学术点评]：溯源。FISH 技术的雏形，定义了原位杂交的基本物理生物学原则。
[3] Bishop AJ, et al. (2023). The role of FISH in the era of Next-Generation Sequencing. Molecular Cytogenetics.
[学术点评]：技术定位。论述了在精准肿瘤学时代，FISH 如何作为验证 NGS 复杂变异结果的关键补充工具。