可逆终止子
可逆终止子（Reversible Terminator，CRT）是二代测序 (NGS) 技术（尤其是 边合成边测序 路线）的化学基石。它是一类经过人工修饰的核苷酸类似物（dNTPs），其 3' 羟基（3'-OH）被一个特殊的化学基团“封锁”，导致 DNA聚合酶 在延伸一个碱基后被迫停止。与 Sanger测序 中使用的“永久终止子”（ddNTP）不同，可逆终止子的封锁基团和荧光标记可以通过化学试剂温和地切除（Cleave），从而恢复 3'-OH 的活性，允许下一轮的聚合反应继续进行。这一“结合-检测-切除”的循环机制，解决了均聚物（Homopolymer）测序难题，奠定了 Illumina 在全球基因组学领域的霸主地位。
分子解剖：精准控制的艺术
一个标准的可逆终止子分子包含三个核心部分，它们共同协作实现了“单碱基延伸”的控制：
- 1. 3'-OH 阻断基团 (Blocking Group)：
这是核心组件。Illumina 主要使用 3'-O-叠氮甲基 (3'-O-azidomethyl)。由于空间位阻较小，它能被工程改造的 DNA 聚合酶接受。它的存在阻止了磷酸二酯键的形成，确保每次循环只添加一个碱基。 - 2. 荧光标记 (Fluorophore)：
碱基（A/T/C/G）上连接着特定的荧光染料。为了防止空间位阻影响聚合酶，染料通常通过一个长链连接子 (Linker) 连接到碱基的 5 位（嘧啶）或 7 位（嘌呤）上。 - 3. 可切除连接 (Cleavable Linker)：
这是“可逆”的关键。阻断基团和荧光连接子通常设计有相同的化学敏感位点（如二硫键或叠氮基）。加入特定试剂（如 TCEP）后，两者同时脱落，DNA 链恢复天然的 3'-OH 结构，且不再发光。
工作循环：结合-检测-切割
可逆终止子使得测序过程变成了离散的步骤，解决了传统测序无法准确读取连续相同碱基（如 AAAAA）的问题。
| 步骤 | 生化反应 | 关键挑战 |
|---|---|---|
| 1. 结合 | 聚合酶将互补的 CRT 添加到引物末端。因 3' 被阻断，反应停止。 | 需要高保真聚合酶，能耐受大体积的荧光基团修饰。 |
| 2. 成像 | TIRF 显微镜拍摄 4 色荧光照片，记录碱基类型。 | 光漂白 (Photobleaching) 会降低信号强度。 |
| 3. 切割 | 加入还原剂 (TCEP)，切除 3' 阻断基团和荧光基团。 | 切割不彻底会导致 Phasing (滞后)，限制了测序读长。 |
进化：从“有痕”到“无痕”
传统的可逆终止子（如 Illumina 使用的）在切割后，会在碱基上残留一个小的化学基团（称为化学疤痕 / Chemical Scar）。随着循环次数增加，这些疤痕会逐渐改变 DNA 双螺旋的空间结构，阻碍聚合酶的结合，导致后续测序质量下降。
华大智造 推出的 CoolMPS 技术通过引入抗体标记的天然碱基，在切割后不留任何痕迹（Scarless），理论上可以实现更长的读长和更高的准确度。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Bentley DR, et al. (2008). Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature.
[点评]：经典文献。详细披露了 Illumina/Solexa 使用的 3'-O-azidomethyl 可逆终止子的化学结构和反应机理。
[2] Ju J, et al. (2006). Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. PNAS.
[点评]：哥伦比亚大学 Jingyue Ju 团队的工作，奠定了 3'-O-allyl 等可逆终止子化学的基础，对后续商业化测序仪影响深远。
[3] Chen CY, et al. (2013). DNA polymerases: structural insights and evolution of a reversible terminator machinery. Current Opinion in Structural Biology.
[点评]：从酶学角度探讨了如何改造 DNA 聚合酶，使其能够高效地识别并结合这种“大个头”的修饰核苷酸。