SMRT
SMRT（Single Molecule, Real-Time，单分子实时测序）是 PacBio 公司开发的三代测序核心技术。它利用纳米光子学原理，在零模波导孔 (ZMW) 底部实时观测单个 DNA聚合酶 合成 DNA 链的过程。
与二代测序（NGS）需要扩增且分步成像不同，SMRT 技术无需 PCR 扩增，直接对原始 DNA 分子进行连续测序，因此具有超长读长（平均 >15kb）和无 GC 偏好的特性。更独特的是，它不仅能读取碱基序列（A/T/C/G），还能通过捕捉聚合酶合成速度的微小变化（动力学特征），直接检测 DNA甲基化 修饰，被誉为“能看懂聚合酶微表情”的技术。
物理学基础：零模波导 (ZMW)
SMRT 技术面临的最大挑战是如何在充满数百万个荧光标记核苷酸的溶液背景中，检测到单个核苷酸被聚合酶捕获时的微弱荧光。PacBio 的解决方案是 零模波导孔 (ZMW)。
| 特性 | 原理描述 |
|---|---|
| 结构 | ZMW 是在 100nm 厚的金属铝膜上打出的直径约 70nm 的小孔，底部是透明玻璃。 |
| 光物理 | 由于孔径小于激光波长，光无法穿过小孔，只能在孔底形成指数衰减的倏逝波 (Evanescent Wave)。 |
| 检测体积 | 有效照明区域被限制在孔底 20-30nm 的范围内，体积仅为 20 仄升 (Zeptoliter, $10^{-21}$ L)。这比普通显微镜的检测体积小 1000 倍，从而将背景噪音降至最低。 |
化学创新：磷酸链标记
SMRT 的另一个关键创新在于核苷酸的标记位置。
- NGS (Illumina)： 荧光基团连接在碱基上。如果不切除，会造成位阻，影响聚合酶活性，导致读长受限。
- SMRT (PacBio)： 荧光基团连接在磷酸链 (Phosphate chain) 的末端。
过程： 当聚合酶将核苷酸掺入 DNA 链时，焦磷酸基团断裂，携带荧光标记自然脱落并扩散出 ZMW。
结果： 合成的 DNA 链是完全天然的（无任何化学修饰残留），因此 Phi29 聚合酶可以保持极高的活性和持续合成能力，实现数万碱基的连续读取。
表观遗传：捕捉酶的“微表情”
SMRT 是目前唯一能直接通过聚合酶动力学检测碱基修饰的技术。聚合酶在通过甲基化碱基（如 6mA 或 5mC）时，其合成速度会发生特征性的改变。
| 参数 | 含义 |
|---|---|
| IPD (Inter-Pulse Duration) | 两个相邻荧光脉冲之间的时间间隔。即聚合酶“结合上一个核苷酸”到“结合下一个核苷酸”的等待时间。 |
| 原理 | 当模板链上存在甲基化修饰（大分子基团）时，聚合酶在通过该位点时会“卡顿”（Hesitation），导致 IPD 显著延长。 |
| 优势 | 无需重亚硫酸盐处理（Bisulfite-free），无损检测。特别擅长检测原核生物的 6mA 和 4mC，以及真核生物的 5mC (在 HiFi 模式下)。 |
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Levene MJ, et al. (2003). Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science.
[点评]：SMRT 技术的物理学基础。首次提出了利用 ZMW 实现高浓度背景下的单分子荧光检测。
[2] Eid J, et al. (2009). Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science.
[点评]：PacBio 的奠基性论文。正式展示了 SMRT 测序的完整流程，证明了实时读取 DNA 序列的可行性。
[3] Flusberg BA, et al. (2010). Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Nature Methods.
[点评]：揭示了 SMRT 测序的另一大潜力——通过动力学信号（IPD）直接读取表观遗传修饰。