PacBio
PacBio（Pacific Biosciences，纳斯达克：PACB）是全球三代测序 (TGS) 技术的奠基者和领导者，总部位于美国加州门洛帕克。其核心技术是基于零模波导孔 (ZMW) 的SMRT（单分子实时）测序。
早期 PacBio 以读长长但错误率高（~15%）著称，但随着HiFi测序（CCS 模式）的推出，PacBio 成功通过算法校正将单分子测序准确率提升至 Q30（>99.9%），兼具了长读长和高准确度。目前，PacBio 凭借旗舰机型 Revio 在全基因组组装、结构变异 (SV) 检测及全长转录组（Iso-Seq）领域占据统治地位，并在收购 Omniome 后推出了基于 SBB 技术的短读长测序仪 Onso。
技术基石：零模波导与荧光监控
SMRT（Single Molecule, Real-Time）测序的核心在于构建一个极其微小的观察窗口，使得光学系统能够实时捕捉单个 DNA 聚合酶的工作状态。
- 零模波导孔 (ZMW)： 这是一个直径仅数十纳米的金属小孔。由于孔径小于激发光的波长，光线无法穿透，只能照亮孔底极小的区域（体积为仄升级，Zeptoliter）。这极大地降低了背景噪音。
- 磷酸标记核苷酸： 与 Illumina 将荧光标记在碱基上不同，PacBio 将荧光标记在核苷酸的磷酸链上。当聚合酶将核苷酸掺入 DNA 链时，焦磷酸基团（携带荧光）自然脱落。
优势： 合成的 DNA 链完全天然，无化学修饰残留，保证了聚合酶的持续高活性和超长读长。
HiFi 革命：以循环换精度
PacBio 最大的转折点在于推出了 HiFi测序（High Fidelity Reads）。在传统的 CLR（Continuous Long Read）模式下，单次读取的随机错误率高达 10%-15%。HiFi 通过循环一致性测序 (CCS) 完美解决了这一问题。
| 步骤 | 描述 |
|---|---|
| 哑铃型文库 | 在双链 DNA 两端连接发夹接头（Hairpin Adapter），使其变成一个封闭的圆环。 |
| 滚环测序 | 聚合酶绕着圆环反复测序，产生包含多个重复序列（Subreads）的超长单链。 |
| 一致性校正 | 由于 SMRT 的错误是随机的，通过将同一分子的多次 Subreads 进行比对，噪音相互抵消，得到的一致性序列（CCS）准确率可达 Q30 (99.9%) 以上。 |
双引擎战略：Revio 与 Onso
PacBio 目前实行“长短结合”的产品战略：
- Revio (长读长旗舰)： 2022 年发布。相比前代 Sequel IIe，ZMW 数量增加了 3 倍（2500 万），计算能力大幅提升。每年可测序 1300 个高覆盖度人类基因组，是目前 HiFi 测序的工业级标准。
- Onso (短读长新秀)： 基于收购 Omniome 获得的 SBB (Sequencing by Binding) 技术。SBB 不依赖聚合反应，而是通过检测结合动力学来识别碱基，准确率高达 Q40（99.99%），旨在挑战 Illumina 在液体活检和罕见突变检测领域的地位。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Wenger AM, et al. (2019). Accurate circular consensus long-read sequencing improves variant detection. Nature Biotechnology.
[点评]：HiFi 测序的奠基之作。证明了 CCS 模式可以在保持长读长的同时，达到甚至超越 NGS 的准确率。
[2] Nurk S, et al. (2022). The complete sequence of a human genome. Science.
[点评]：T2T 基因组计划的核心成果。HiFi Reads 提供了高精度的骨架，是解决基因组复杂重复区域的关键。
[3] Eid J, et al. (2009). Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science.
[点评]：PacBio 早期的原理性论文，首次展示了 ZMW 和 SMRT 测序的可行性。