纳米孔测序
纳米孔测序（Nanopore Sequencing）是三代测序 (TGS) 技术的代表，尤以 Oxford Nanopore (ONT) 平台最为成熟。与依赖化学合成和光学信号的二代测序（NGS）截然不同，纳米孔测序基于纯物理学原理：利用马达蛋白牵引核酸分子（DNA或RNA）穿过纳米尺度的蛋白孔道。当不同碱基（A/T/C/G）通过孔道时，会引起跨膜离子电流发生特征性的微小变化（电流阻断）。
该技术无需 PCR 扩增，可直接测定原始 DNA 或 RNA 分子，因此具备超长读长（可达 Mb 级）、实时数据产出以及直接甲基化检测三大核心优势。它是实现 T2T基因组（端粒到端粒）组装和复杂结构变异（SV）检测的关键工具。
核心原理：解读“电流波形”
纳米孔测序的本质是检测单分子通过孔道时引起的离子电流扰动。
- 1. 硬件架构： 核心是一层高电阻的聚合物膜，膜上嵌有经生物工程改造的蛋白孔（如 CsgG）。膜两侧浸泡在电解质溶液中，并施加电压，形成稳定的离子流。
- 2. 过孔 (Translocation)： 马达蛋白（Helicase）结合在 DNA 模板上，解开双螺旋，并像棘轮一样控制 DNA 单链以恒定速度（约 400 碱基/秒）穿过纳米孔。
- 3. 信号产生： 由于 A、T、C、G 的分子体积和化学性质不同，它们在通过孔道最窄处（Sensing zone）时，对离子流的阻碍程度不同。这种阻碍形成了特征性的电流波形，被称为 Squiggle Plot。
- 4. 碱基识别 (Basecalling)： 原始电信号极其复杂（受相邻 5-6 个碱基的 K-mer 共同影响）。通过 深度学习 算法（如 RNN, Transformer），将这些电信号解码为碱基序列。
长读长革命：跨越基因组暗区
相比于 Illumina 的短读长（~150 bp），纳米孔测序的读长仅受限于 DNA 提取时的完整性，理论上没有上限。
| 应用场景 | 短读长困境 (NGS) | 纳米孔优势 (TGS) |
|---|---|---|
| 基因组组装 | 被重复序列（Repeats）打断，只能得到碎片化的 Contigs。 | 一步跨越重复区，实现 Contig N50 达到 Mb 级别，甚至 T2T 组装。 |
| 结构变异 (SV) | 难以检测大片段插入、缺失或倒位。 | 直接读取断点（Breakpoint），是诊断罕见遗传病的利器。 |
| 单倍体分型 | 无法区分突变来自父本还是母本（Phasing）。 | 长读长自然连接了相距甚远的杂合位点，实现全基因组定相。 |
超越序列：直接检测修饰
由于纳米孔测序不经过 PCR 扩增（PCR 会抹除甲基化修饰），原始 DNA 上的修饰基团会被保留。
● 甲基化检测： 甲基化的胞嘧啶（5mC）通过孔道时，引起的电流阻断与普通胞嘧啶（C）有细微差别。深度学习模型可以直接区分这一差异。这意味着无需重亚硫酸盐处理 (Bisulfite-free) 即可同时获得序列和表观信息。
● 直接 RNA 测序： 可以直接测序 RNA 分子（而非 cDNA），从而检测 RNA 甲基化（如 m6A）并准确分析 Poly(A) 尾长度。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Jain M, et al. (2018). Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology.
[点评]：里程碑论文。展示了利用 MinION 测序人类全基因组的能力，并首次实现了单次读取超长 Read (N50 > 100kb)。
[2] Wang Y, et al. (2021). Delineating the ras gene mutation and methylation landscape in cancer using nanopore sequencing. Nature (Reference context).
[点评]：T2T 联盟（Telomere-to-Telomere）完成人类基因组完整图谱的关键工作中，纳米孔的超长读长起到了决定性作用。
[3] Deamer D, Akeson M, Branton D. (2016). Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology.
[点评]：回顾了纳米孔技术从 1990 年代的概念提出到商业化落地的艰辛历程，涉及关键的生物孔改造和流体控制技术。