边合成边测序
边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）是二代测序 (NGS) 中占据绝对统治地位的核心技术原理，尤以 Illumina 平台为代表。其基本逻辑是模拟体内 DNA 复制过程，利用 DNA聚合酶 将核苷酸逐个添加到引物链上，通过检测每个循环中新加入核苷酸所释放的特定信号（荧光、光子或氢离子）来确定序列信息。
与第一代 Sanger测序 的“末端终止”不同，SBS 采用“可逆终止”或“分步添加”策略，实现了大规模并行测序。尽管面临 三代测序 长读长的挑战，SBS 凭借其超高的准确度（Q30 > 85%）和极低的单位碱基成本，依然是目前全球基因组学研究和临床检测（如 NIPT、肿瘤伴随诊断）的“金标准”技术。
核心机制：可逆终止子 (CRT)
Illumina 的 SBS 技术之所以能战胜 Roche 454 和 SOLiD，关键在于其精妙的可逆终止子 (Cyclic Reversible Termination) 化学反应。这是一个周而复始的 4 步循环：
- 1. 结合 (Incorporation)： 向流动槽中加入 DNA 聚合酶和所有 4 种带有不同荧光标记的核苷酸（dNTPs）。这些 dNTPs 的 3'-OH 被一个化学基团（如叠氮基团）“封锁”。聚合酶只能延伸一个碱基，反应即刻停止。
- 2. 扫描 (Imaging)： 洗去未结合的 dNTPs，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）对芯片进行扫描。根据捕捉到的荧光颜色（红、绿、蓝、黄）判断刚刚结合的是 A、T、C 还是 G。
- 3. 切除 (Cleavage)： 加入化学试剂，切除 3'-OH 上的封锁基团和荧光基团，恢复 3'-OH 的活性，使其准备好接受下一个碱基。
- 4. 洗脱与循环： 清洗反应体系，开始下一轮循环。如此重复 150-300 次（即 PE150）。
技术流派：殊途同归
除了 Illumina 的荧光标记法，SBS 还有其他检测信号的实现方式：
| 平台 | 信号机制 | 特点 |
|---|---|---|
| Illumina | 荧光 (4色/2色/1色) | 准确度最高，但光学系统复杂，扫描耗时。 |
| Ion Torrent | 半导体 pH 感应 | 检测释放的 $H^+$ 离子。速度快，无光学系统，但均聚物 (Homopolymer, 如 AAAAA) 测序困难。 |
| 华大智造 | cPAS / CoolMPS | 利用抗体与未标记核苷酸结合（CoolMPS），信号更强，无“光疤痕”效应。 |
技术瓶颈：相位失衡 (Phasing)
SBS 最大的限制在于读长无法无限延伸，主要原因是化学反应效率无法达到 100%，导致 DNA 簇中的分子步调不一致，统称Phasing：
- 滞后 (Phasing)： 某些分子在当前循环未结合核苷酸，导致落后一拍。
- 超前 (Pre-phasing)： 某些分子的 3' 阻断基团未被有效添加或意外脱落，导致在一个循环中结合了两个核苷酸，快了一拍。
- 结果： 随着循环数增加，噪音信号逐渐累积，导致 Read 末端的质量值（Q-Score）急剧下降。这就是为什么 NGS 读长通常限制在 300bp 以内。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Bentley DR, et al. (2008). Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature.
[点评]：Illumina 技术的奠基论文，首次详细阐述了 SBS 和可逆终止子的化学原理。
[2] Fuller CW, et al. (2009). The challenges of sequencing by synthesis. Nature Biotechnology.
[点评]：深度剖析了 SBS 技术面临的生化挑战，如核苷酸的结合动力学、荧光基团的切割效率及 Phasing 问题。
[3] Goodwin S, et al. (2016). Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics.
[点评]：行业必读综述。对比了 SBS 与 SMRT、Nanopore 等技术的优劣，指出了 SBS 在短读长高精度领域的统治地位。