Sanger测序
Sanger测序（Sanger Sequencing），又称为双脱氧链终止法（Dideoxy Chain Termination Method），是由英国生物化学家 Frederick Sanger 于 1977 年发明的 DNA 测序技术（因此获得诺贝尔奖）。该技术利用特殊的双脱氧核苷酸 (ddNTP) 作为扩增反应的“刹车片”，在 DNA 聚合过程中随机终止链的延伸，从而产生一系列长度不等的 DNA 片段，最后通过毛细管电泳读取序列。尽管高通量测序（NGS）已普及，但凭借其99.99% 的超高准确率和较长的读长（800-1000 bp），Sanger 测序至今仍被视为基因检测的“金标准”，广泛用于验证 NGS 结果、质粒测序及单基因遗传病的诊断。
核心原理：缺少氧原子的“刹车”
DNA 聚合酶合成 DNA 时，需要上一个核苷酸的 3'-OH（羟基）与下一个核苷酸的 5'-磷酸基团形成磷酸二酯键。Sanger 测序巧妙地引入了 ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）：
- 正常原料 (dNTP)： 含有 3'-OH，支持 DNA 链继续延伸。
- 终止原料 (ddNTP)： 缺失 3'-OH，一旦被聚合酶整合进 DNA 链，后续的核苷酸无法连接，合成反应立即终止。
在反应体系中加入四种带有不同荧光标记的 ddNTP（A-绿, T-红, C-蓝, G-黑），反应结束后会产生一系列长度相差 1 个碱基的片段。通过毛细管电泳按大小分离，即可读出序列。
Sanger vs. NGS：森林与树木
应用法则： 如果你要测人类全基因组，请用 NGS（看森林）；如果你要确认某位患者的 BRCA1 基因第 5 外显子是否有一个点突变，请用 Sanger（看树木）。
| 特性 | Sanger 测序 (一代) | NGS (二代, 如 Illumina) |
|---|---|---|
| 单次读长 | 长 (~1000 bp) | 短 (~150 bp, PE150) |
| 准确性 | 极高 (单次即可信) | 较高 (需深度覆盖) |
| 单位成本 | 高 (按反应收费) | 极低 (按 Gb 收费) |
| 核心用途 | 验证 (Validation), 单基因病 | 全基因组/外显子组筛查 |
常见问题：套峰 (Double Peak)
杂合突变的标志
在查看 Sanger 测序峰图时，如果在某个位置出现了两种颜色的波峰重叠，且高度约为周围单峰的一半，通常提示该位点存在杂合突变（即一条染色体是野生型，另一条是突变型）。这是诊断遗传病最直观的证据。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS.
[点评]：生物学史上被引用次数最多的文献之一，标志着基因组学时代的开启。Sanger 凭此获得第二枚诺贝尔化学奖。
[2] Lander ES, et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature.
[点评]：人类基因组计划（HGP）主要就是依靠改进版的自动化 Sanger 测序仪（ABI 3700）完成的。
[3] Shendure J, Ji H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology.
[点评]：回顾了从 Sanger 到 NGS 的技术演变，强调了 Sanger 在验证 NGS 变异中的持续重要性。