Cas9
Cas9（CRISPR-associated protein 9）是一种 RNA 导向的 DNA 核酸内切酶，是 II 型 CRISPR 免疫系统中的核心效应蛋白。最经典的 Cas9 来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes），被称为 SpCas9。在 sgRNA 的引导下，Cas9 蛋白能够发生构象变化，像“拉链”一样解开 DNA 双螺旋并精准识别靶序列。Cas9 拥有两个独立的切割结构域——HNH 和 RuvC，分别切割 DNA 的互补链和非互补链，从而产生平末端（Blunt end）的双链断裂。通过对这两个结构域进行突变，科学家还开发出了丧失切割活性但保留定位功能的 dCas9，将其转化为基因调控或表观遗传修饰的通用平台。
结构域功能：精密的分子机器
Cas9 蛋白由多个功能明确的结构域组成，它们协同工作完成 DNA 的识别与切割：
- REC (Recognition) 结构域： 负责结合 sgRNA，是 Cas9 最大的部分，决定了酶的特异性。
- PI (PAM Interacting) 结构域： 位于蛋白末端，负责扫描 DNA 上的 PAM 序列（如 NGG），是启动结合的“锚点”。
- HNH 核酸酶结构域： 结构类似于细菌毒素，负责切割与 sgRNA 互补配对的那条 DNA 链（Target strand）。
- RuvC 核酸酶结构域： 类似于逆转录病毒整合酶，负责切割非互补链（Non-target strand）。
家族成员与工程化变体
AAV 载体的挑战： 标准的 SpCas9 基因较长（~4.2kb），很难装入临床常用的 AAV 病毒载体（容量限 ~4.7kb）。因此，科学家发现了体型更小的 SaCas9。
| 变体名称 | 特点与来源 | 主要应用 |
|---|---|---|
| SpCas9 | S. pyogenes 来源，PAM为 NGG。活性最高。 | 实验室通用，体外编辑。 |
| SaCas9 | S. aureus 来源，分子量小 (~124 kDa)，PAM为 NNGRRT。 | 体内基因治疗 (易于 AAV 递送)。 |
| dCas9 (Dead) | HNH 和 RuvC 双突变 (D10A, H840A)，只结合不切割。 | CRISPRa/i (转录调控), 荧光标记。 |
| nCas9 (Nickase) | 单突变，只切断一条链（缺口酶）。 | 碱基编辑 (Base Editing), 先导编辑。 |
相关概念：Cas9 vs. Cas12a (Cpf1)
另一种剪刀
Cas12a (Cpf1) 是另一种常用的核酸酶。与 Cas9 切割出平末端不同，Cas12a 切割后产生 粘性末端 (Sticky ends)，且识别富含 T 的 PAM 序列。这使得 Cas12a 在某些需要精准片段插入的场景下优于 Cas9。
学术参考文献 [Academic Review]
[1] Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, et al. (2014). Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell.
[点评]：首次解析了 Cas9-sgRNA-DNA 三元复合物的晶体结构，从原子水平揭示了 HNH 和 RuvC 如何执行切割。
[2] Ran FA, Cong L, Yan WX, et al. (2015). In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature.
[点评]：开发了小分子的 SaCas9，解决了将 CRISPR 系统包装进 AAV 病毒进行体内治疗的尺寸难题。
[3] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature.
[点评]：利用 dCas9/nCas9 融合脱氨酶构建了第一代“碱基编辑器”（Base Editor），实现了不切断 DNA 的单碱基突变。