RNA-seq

RNA测序
RNA Sequencing (RNA-seq)

RNA 转录组学研究的核心技术
英文全称	RNA Sequencing
核心输入	总 RNA / mRNA
定量指标	TPM、FPKM、RPKM
分析重点	差异表达基因 (DEG)
临床应用	标志物发现、药物靶点

RNA测序（RNA Sequencing，简称 RNA-seq）是基于下一代测序（NGS）技术的研究转录组学（Transcriptomics）的核心手段。它通过对样本中的全 RNA 或特定 RNA 组分（如 mRNA）进行文库构建及高通量测序，能够精确地检测基因的表达水平、剪接变异、融合基因以及单核苷酸变异。

相较于传统的微阵列（Microarray）技术，RNA-seq 具有更高的检测灵敏度、更宽的线性动态范围，且无需预先设计探针，从而能够发现全新的转录本。

实验流程

RNA-seq 的标准流程通常分为以下关键环节：

1. **样本制备与质控**：提取高质量的总 RNA，并通过电泳评估其完整性（RIN 值）。
2. **文库构建**：包括 RNA 富集（如 Poly-A 捕获）、片段化、反转录为 cDNA、加接头及 PCR 扩增。
3. **高通量测序**：在 Illumina、MGI 或长读长平台（如 PacBio/Nanopore）上进行测序。
4. **生物信息学分析**：
   • 原始数据质控（Raw Data QC）。
   • 序列比对（Alignment）：将 Reads 比对至参考基因组（如使用 STAR 或 HISAT2）。
   • 表达定量：计算基因或转录本的丰度。
   • 差异分析：利用 $log_2(\text{fold change})$ 和校正后的 $P$ 值筛选差异基因。

主要技术参数与定量策略

RNA-seq 常用定量指标对比

指标名称	特点与适用场景
**TPM**	转录本每百万映射数。目前学术界最推荐的指标，便于不同样本间的直接比较，确保每样本总量之和相等。
**FPKM/RPKM**	考虑了基因长度和测序深度的标准化方法。虽然应用广泛，但在样本间横向对比时存在一定的数学偏差。
**Counts**	原始比对上的 Reads 计数。是 DESeq2 等差异分析软件的必需输入值，保留了原始统计分布信息。

2025 年的技术前沿

• **单细胞 RNA-seq (scRNA-seq)**：在单细胞水平上解析细胞异质性，已成为免疫浸润和发育生物学的金标准。
• **空间转录组学 (Spatial Transcriptomics)**：在保留组织空间位置信息的同时进行 RNA 测序，揭示肿瘤微环境中的原位相互作用。
• **长读长转录组 (Iso-seq)**：能够完整覆盖转录本的全长，极大提升了对复杂剪接异构体（Isoforms）的识别精度。

参考文献

• [1] Wang Z, et al. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 2009.
• [2] Stark R, et al. RNA sequencing: the teenage years. Nature Reviews Genetics. 2019.
• [3] Mortazavi A, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 2008.

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