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边合成边测序 - 版本历史
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<br />
<div style="margin-bottom: 30px; border-bottom: 1.2px solid #e2e8f0; padding-bottom: 25px;"><br />
<p style="font-size: 1.1em; margin: 10px 0; color: #334155; text-align: justify;"><br />
<strong>边合成边测序</strong>（Sequencing by Synthesis，SBS）是<strong>[[二代测序]] (NGS)</strong> 中占据绝对统治地位的核心技术原理，尤以 <strong>[[Illumina]]</strong> 平台为代表。其基本逻辑是模拟体内 DNA 复制过程，利用 <strong>[[DNA聚合酶]]</strong> 将核苷酸逐个添加到引物链上，通过检测每个循环中新加入核苷酸所释放的特定信号（荧光、光子或氢离子）来确定序列信息。<br />
<br>与第一代 <strong>[[Sanger测序]]</strong> 的“末端终止”不同，SBS 采用“可逆终止”或“分步添加”策略，实现了大规模并行测序。尽管面临 <strong>[[三代测序]]</strong> 长读长的挑战，SBS 凭借其超高的准确度（Q30 > 85%）和极低的单位碱基成本，依然是目前全球基因组学研究和临床检测（如 <strong>[[NIPT]]</strong>、肿瘤伴随诊断）的“金标准”技术。<br />
</p><br />
</div><br />
<br />
<div class="medical-infobox mw-collapsible mw-collapsed" style="width: 100%; max-width: 320px; margin: 0 auto 35px auto; border: 1.2px solid #bae6fd; border-radius: 12px; background-color: #ffffff; box-shadow: 0 8px 20px rgba(0,0,0,0.05); overflow: hidden;"><br />
<br />
<div style="padding: 15px; color: #1e40af; background: linear-gradient(135deg, #e0f2fe 0%, #bae6fd 100%); text-align: center; cursor: pointer;"><br />
<div style="font-size: 1.2em; font-weight: bold; letter-spacing: 1.2px;">边合成边测序</div><br />
<div style="font-size: 0.7em; opacity: 0.85; margin-top: 4px; white-space: nowrap;">Sequencing by Synthesis (点击展开)</div><br />
</div><br />
<br />
<div class="mw-collapsible-content"><br />
<div style="padding: 25px; text-align: center; background-color: #f8fafc;"><br />
<div style="width: 100px; height: 100px; background-color: #e2e8f0; border-radius: 50%; margin: 0 auto; display: flex; align-items: center; justify-content: center; color: #94a3b8; font-size: 0.8em;"><br />
<br />
</div><br />
<div style="font-size: 0.8em; color: #64748b; margin-top: 12px; font-weight: 600;">NGS 的核心化学引擎</div><br />
</div><br />
<br />
<table style="width: 100%; border-spacing: 0; border-collapse: collapse; font-size: 0.85em;"><br />
<tr><br />
<th colspan="2" style="padding: 8px 12px; background-color: #e0f2fe; color: #1e40af; text-align: left; font-size: 0.9em; border-top: 1px solid #bae6fd;">技术概况</th><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; width: 40%;">英文缩写</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #0f172a;">SBS</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">核心酶</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #1e40af;">[[DNA聚合酶]] (工程改造)</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">关键试剂</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #16a34a;">[[可逆终止子]] (CRT)</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">读长范围</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #0f172a;">50 bp - 600 bp (PE150)</td><br />
</tr><br />
<br />
<tr><br />
<th colspan="2" style="padding: 8px 12px; background-color: #e0f2fe; color: #1e40af; text-align: left; font-size: 0.9em; border-top: 1px solid #bae6fd;">主要流派</th><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">荧光检测</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #1e40af;">[[Illumina]] (Solexa)</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">电位/pH</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #0f172a;">Ion Torrent</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569; border-bottom: 1px solid #e2e8f0;">焦磷酸</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; color: #0f172a;">Roche 454 (已停产)</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<th style="text-align: left; padding: 6px 12px; background-color: #f8fafc; color: #475569;">主要限制</th><br />
<td style="padding: 6px 12px; color: #e11d48;">[[Phasing]] (相位/步调失衡)</td><br />
</tr><br />
</table><br />
</div><br />
</div><br />
<br />
<h2 style="background: #f1f5f9; color: #0f172a; padding: 10px 18px; border-radius: 0 6px 6px 0; font-size: 1.25em; margin-top: 40px; border-left: 6px solid #0f172a; font-weight: bold;">核心机制：可逆终止子 (CRT)</h2><br />
<br />
<p style="margin: 15px 0; text-align: justify;"><br />
Illumina 的 SBS 技术之所以能战胜 Roche 454 和 SOLiD，关键在于其精妙的<strong>[[可逆终止子]] (Cyclic Reversible Termination)</strong> 化学反应。这是一个周而复始的 4 步循环：<br />
</p><br />
<br />
<div style="background-color: #f0f9ff; border-left: 5px solid #1e40af; padding: 15px 20px; margin: 20px 0; border-radius: 4px;"><br />
<ul style="margin: 0; padding-left: 20px; color: #334155;"><br />
<li style="margin-bottom: 8px;"><strong>1. 结合 (Incorporation)：</strong> 向[[流动槽]]中加入 DNA 聚合酶和所有 4 种带有不同荧光标记的核苷酸（dNTPs）。这些 dNTPs 的 <strong>3'-OH</strong> 被一个化学基团（如叠氮基团）“封锁”。聚合酶只能延伸一个碱基，反应即刻停止。</li><br />
<li style="margin-bottom: 8px;"><strong>2. 扫描 (Imaging)：</strong> 洗去未结合的 dNTPs，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）对芯片进行扫描。根据捕捉到的荧光颜色（红、绿、蓝、黄）判断刚刚结合的是 A、T、C 还是 G。</li><br />
<li style="margin-bottom: 8px;"><strong>3. 切除 (Cleavage)：</strong> 加入化学试剂，切除 3'-OH 上的封锁基团和荧光基团，恢复 3'-OH 的活性，使其准备好接受下一个碱基。</li><br />
<li style="margin-bottom: 0;"><strong>4. 洗脱与循环：</strong> 清洗反应体系，开始下一轮循环。如此重复 150-300 次（即 PE150）。</li><br />
</ul><br />
</div><br />
<br />
<h2 style="background: #f1f5f9; color: #0f172a; padding: 10px 18px; border-radius: 0 6px 6px 0; font-size: 1.25em; margin-top: 40px; border-left: 6px solid #0f172a; font-weight: bold;">技术流派：殊途同归</h2><br />
<br />
<p style="margin: 15px 0; text-align: justify;"><br />
除了 Illumina 的荧光标记法，SBS 还有其他检测信号的实现方式：<br />
</p><br />
<br />
<div style="overflow-x: auto; margin: 20px auto;"><br />
<table style="width: 100%; border-collapse: collapse; border: 1.2px solid #cbd5e1; font-size: 0.9em; text-align: left;"><br />
<tr style="background-color: #f1f5f9; border-bottom: 2px solid #0f172a;"><br />
<th style="padding: 12px; border: 1px solid #cbd5e1; color: #0f172a; width: 25%;">平台</th><br />
<th style="padding: 12px; border: 1px solid #cbd5e1; color: #1e40af; width: 35%;">信号机制</th><br />
<th style="padding: 12px; border: 1px solid #cbd5e1; color: #475569; width: 40%;">特点</th><br />
</tr><br />
<tr><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1; font-weight: 600;">[[Illumina]]</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">荧光 (4色/2色/1色)</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">准确度最高，但光学系统复杂，扫描耗时。</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1; font-weight: 600;">Ion Torrent</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">半导体 pH 感应</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">检测释放的 $H^+$ 离子。速度快，无光学系统，但<strong>均聚物</strong> (Homopolymer, 如 AAAAA) 测序困难。</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1; font-weight: 600;">[[华大智造]]</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">cPAS / CoolMPS</td><br />
<td style="padding: 10px; border: 1px solid #cbd5e1;">利用抗体与未标记核苷酸结合（CoolMPS），信号更强，无“光疤痕”效应。</td><br />
</tr><br />
</table><br />
</div><br />
<br />
<h2 style="background: #f1f5f9; color: #0f172a; padding: 10px 18px; border-radius: 0 6px 6px 0; font-size: 1.25em; margin-top: 40px; border-left: 6px solid #0f172a; font-weight: bold;">技术瓶颈：相位失衡 (Phasing)</h2><br />
<br />
<p style="margin: 15px 0; text-align: justify;"><br />
SBS 最大的限制在于读长无法无限延伸，主要原因是化学反应效率无法达到 100%，导致 DNA 簇中的分子步调不一致，统称<strong>[[Phasing]]</strong>：<br />
</p><br />
<ul style="padding-left: 25px; color: #334155; margin-top: 15px;"><br />
<li style="margin-bottom: 12px;"><strong>滞后 (Phasing)：</strong> 某些分子在当前循环未结合核苷酸，导致落后一拍。</li><br />
<li style="margin-bottom: 12px;"><strong>超前 (Pre-phasing)：</strong> 某些分子的 3' 阻断基团未被有效添加或意外脱落，导致在一个循环中结合了两个核苷酸，快了一拍。</li><br />
<li style="margin-bottom: 12px;"><strong>结果：</strong> 随着循环数增加，噪音信号逐渐累积，导致 Read 末端的质量值（Q-Score）急剧下降。这就是为什么 NGS 读长通常限制在 300bp 以内。</li><br />
</ul><br />
<br />
<div style="font-size: 0.92em; line-height: 1.6; color: #1e293b; margin-top: 50px; border-top: 2px solid #0f172a; padding: 15px 25px; background-color: #f8fafc; border-radius: 0 0 10px 10px;"><br />
<span style="color: #0f172a; font-weight: bold; font-size: 1.05em; display: inline-block; margin-bottom: 15px;">学术参考文献 [Academic Review]</span><br />
<br />
<p style="margin: 12px 0; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; padding-bottom: 10px;"><br />
[1] <strong>Bentley DR, et al. (2008).</strong> <em>Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</em> <strong>[[Nature]]</strong>. <br><br />
<span style="color: #475569;">[点评]：Illumina 技术的奠基论文，首次详细阐述了 SBS 和可逆终止子的化学原理。</span><br />
</p><br />
<br />
<p style="margin: 12px 0; border-bottom: 1px solid #e2e8f0; padding-bottom: 10px;"><br />
[2] <strong>Fuller CW, et al. (2009).</strong> <em>The challenges of sequencing by synthesis.</em> <strong>[[Nature Biotechnology]]</strong>. <br><br />
<span style="color: #475569;">[点评]：深度剖析了 SBS 技术面临的生化挑战，如核苷酸的结合动力学、荧光基团的切割效率及 Phasing 问题。</span><br />
</p><br />
<br />
<p style="margin: 12px 0;"><br />
[3] <strong>Goodwin S, et al. (2016).</strong> <em>Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</em> <strong>[[Nature Reviews Genetics]]</strong>. <br><br />
<span style="color: #475569;">[点评]：行业必读综述。对比了 SBS 与 SMRT、Nanopore 等技术的优劣，指出了 SBS 在短读长高精度领域的统治地位。</span><br />
</p><br />
</div><br />
<br />
<div style="margin: 40px 0; border: 1px solid #e2e8f0; border-radius: 8px; overflow: hidden; font-family: 'Helvetica Neue', Arial, sans-serif; font-size: 0.9em;"><br />
<div style="background-color: #eff6ff; color: #1e40af; padding: 8px 15px; font-weight: bold; text-align: center; border-bottom: 1px solid #dbeafe;"><br />
测序原理解析 · 知识图谱<br />
</div><br />
<table style="width: 100%; border-collapse: collapse; background-color: #ffffff;"><br />
<tr style="border-bottom: 1px solid #f1f5f9;"><br />
<td style="width: 85px; background-color: #f8fafc; color: #334155; font-weight: 600; padding: 10px 12px; text-align: right; vertical-align: middle;">上级分类</td><br />
<td style="padding: 10px 15px; color: #334155;">[[高通量测序]] (NGS)</td><br />
</tr><br />
<tr style="border-bottom: 1px solid #f1f5f9;"><br />
<td style="width: 85px; background-color: #f8fafc; color: #334155; font-weight: 600; padding: 10px 12px; text-align: right; vertical-align: middle;">核心组件</td><br />
<td style="padding: 10px 15px; color: #334155;">[[流动槽]] • [[可逆终止子]] • 荧光dNTP</td><br />
</tr><br />
<tr><br />
<td style="width: 85px; background-color: #f8fafc; color: #334155; font-weight: 600; padding: 10px 12px; text-align: right; vertical-align: middle;">代表平台</td><br />
<td style="padding: 10px 15px; color: #334155;">[[Illumina]] (NovaSeq) • [[华大智造]] (cPAS) • Ion Torrent</td><br />
</tr><br />
</table><br />
</div><br />
<br />
</div></div>
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