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2014-03-02T17:09:52Z

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[[免疫细胞化学]]（immunocytochemistry）术是应用[[抗原]]与[[抗体]]结合的[[免疫学]]原理，检测细胞内[[多肽]]、[[蛋白质]]及膜[[表面抗原]]和[[受体]]等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为[[生物学]]和医学众多学科的重要研究手段。近年随着[[纯化]]抗原和制备[[单克隆抗体]]的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫细胞化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于[[疾病]]的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有[[抗原性]]。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的[[特异性抗体]]（[[免疫球蛋白]]）。从被[[免疫]]动物的[[血清]]中提取出该抗体，再以[[荧光素]]、酶、[[铁蛋白]]或[[胶体]]金标记，用这种标记抗体处理[[组织切片]]或[[细胞]]，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合（图1-4)。常用的荧光素是[[异硫氰酸荧光素]]（FITC)和四甲基异硫氰酸[[罗丹明]]（TRITC），在[[荧光显微镜]]下可观察[[荧光抗体]]抗原[[复合物]]（图1－5）。常用的酶是[[辣根]]过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从[[辣根菜]]中提取的），它的[[底物]]是3，3'－二氨基、[[联苯胺]]（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察（图1－6）。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察（图1－7）。

{{图片|gunkas1i.jpg|[[大鼠]][[腺垂体]]免疫组织化学（PAS法）示[[生长激素]]细胞 }}

图1－6 大鼠腺垂体免疫组织化学（PAS法）示生长激素细胞

（上海医科大赵培林教授供图）

{{图片|gunkautr.jpg|免疫细胞化学（[[蛋白]]A-胶体金法）和[[原位杂交]]术示大鼠[[垂体]] }}

图1-7 免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体

[[催乳素]]细胞电镜像 N催乳素[[细胞核]]

↑分泌颗粒内显示金粒

{{图片|gunkamvf.gif|[[粗面内质网]]（RER）显示银粒 }}

粗面内质网（RER）显示银粒

（加拿大Douglas[[医院]]研究中心童毅爱博士赠图）

标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合（图1－8）。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以[[标记物]]标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物（图1－8）。间接法中的一个抗原[[分子]]可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为[[过氧化物酶]]－抗过氧化物酶[[复合物法]]（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。[[标本]]先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强（图1－9）。

{{图片|gunkak3w.jpg| 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图}}

图1－8 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图

{{图片|gunkah70.jpg| 免疫细胞化学PAP法示意图}}

图1－9 免疫细胞化学PAP法示意图

免疫细胞化学术近10年来又有新进展，如[[生物素]]－亲合素等新颖[[试剂]]的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称[[维生素H]]，是从[[卵黄]]和肝中提取的一种[[小分]]子物质（[[分子量]]244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种[[糖蛋白]]（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个[[位点]]，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素－亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素－[[生物素法]]（labelled avidin- biotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性（图1－10）。②桥连亲合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果（图1－10）。③亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的[[复合体]]，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度（图1－10）。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。

{{图片|gunkap8z.jpg|生物素－亲合素免疫细胞化学示意图 }}

图1－10 生物素－亲合素免疫细胞化学示意图

（1）标记亲合素－生物素法

（2）桥连亲合素－生物素法

（3）亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（ABC法）
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