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2014-02-05T14:06:52Z

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（一）模板[[核酸]]

PCR可以以[[DNA]]或[[RNA]]为模板进行核酸的体外[[扩增]]。不过RNA的扩增首先[[逆转录]]成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸[[标本]]必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。[[采集标本]]方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现[[假阴性]]。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。

（二）[[引物]]

PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]或反向[[高压]]液相层析（HPLC）[[纯化]]。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和[[脱嘌呤]]产物以及可检测到的[[碱基]]修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。[[冻干]]引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。

PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物[[二聚体]]的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的[[底物]]，与靶序列竞争DNA[[聚合酶]]，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。

（三）[[缓冲液]]

PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L　Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。

反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/lNaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛[[血清白蛋白]]（100μg/ml）或[[明胶]]（0.01%）或Tween20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的[[二硫苏糖醇]]（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。

（四）[[Mg]]2+

Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的[[解链温度]]，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp的[[磷酸基]]团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。

（五）三磷酸[[脱氧核苷]]酸（dNTP）

四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。

（六）耐热DNA聚合酶

PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为Taq DNA聚合酶取代了[[大肠杆菌]]DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而[[失活]]是PCR实验失败的常见原因。

（七）温度循环参数

1．[[变性温度]]与时间

PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响TaqDNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。

2．[[复性]]温度与时间

变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。

3．延伸温度与时间

[[引物延伸]]温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶[[基因]]的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，[[核苷酸]]的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。

4．循环数：

循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，[[酶活性]]不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。
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基因诊断与性病/PCR反应的基本条件及其对PCR的影响 - 版本历史

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