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2014-02-05T14:08:49Z

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'''一、诊断依据：'''

（一）[[流行病学]]及[[临床表现]]

（二） [[实验室检查]]

（1）主要是中度以上[[细胞免疫]]缺陷包括：CD4+T [[淋巴细胞]]耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周[[血淋]]巴[[细胞]]显着减少，CD4&lt;200/μl，CD4/CD8&lt;1.0，（正常人为1.25～2.1），迟发型[[变态反应]]皮试阴性，[[有丝分裂]]原[[刺激反应]]低下。

（2）B淋巴细胞功能失调：多克隆性[[高球蛋白血症]]，[[循环免疫复合物]]形成和[[自身抗体]]形成。

（3）NK细胞活性下降

（4）各种[[致病性]][[感染]]的[[病原体]]检查如PCR。[[组织学]]证实的[[恶性肿瘤]]，如KS；

（三）[[HIV]][[抗体]]检测

1.[[酶联免疫吸附法]]（ELISA）；2.[[明胶]]颗粒[[凝集]]试验（[[PA]]）；3.[[免疫荧光]]检测法（IFA）；4.[[免疫]]印迹检测法（Western Blot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV[[病毒]]。

（四）PCR技术检测HIV病毒

1．[[标本]]的采集与模板[[核酸]]的制备。从怀疑为[[AIDS]]和ARC患者以及无症状的同性恋者采集[[血液标本]]，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚[[蔗糖]]（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的[[新生儿]]的血液标本。

可采用下述方法自血液标本中分离外周血[[单核细胞]]（PMC）：

① 取4ml[[血液]]用Hanks液1：1稀释。

② 向含有1份[[淋巴细胞分离液]]的[[试管]]内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。

③ 2500r/min离心20min。

④ 吸出介于淋巴细胞分散液和[[血浆]]层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。

⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎[[牛血清]]，10%[[白介素-2]]，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血[[凝集素]]P）,使细胞浓度为2×106/ml。

⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的[[靶细胞]]。

2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的[[试剂]]因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取[[DNA]]和[[RNA]]的方法。

（1）从外周血单核细胞中提取DNA

方法A：

①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小[[离心管]]内。

②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

③2500r/min离心10min，弃上清。

④沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。

⑤加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。

⑥　于37℃保湿后置冰箱保存。

该方法也适用于无Glyciegel保存的[[肝素]]标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。

方法B：

①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。

②2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，[[上清液]]可作[[血清学]]研究用。

③用10ml0.9%NaCl（含50%[[葡萄糖]]）将沉淀的细胞洗一次。

④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。

⑤通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。

⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解[[缓冲液]]（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml[[蛋白酶]]K）中使细胞裂解。

⑦用酚一[[氯仿]]抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。

⑧加入3倍体积的[[无水乙醇]]，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。

该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。

（2）从外周血单核细胞中提取RNA及其[[反转录]]

方法A：

① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。

② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。

③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。

④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。

⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。

⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。

在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR[[扩增]]。RNA反转录操作如（7）～（9）。

⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。

⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。

⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。

方法B：

①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。

②40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。

③将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L[[柠檬酸]]缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基[[乙醇]]）中充分混匀.

④加入30μl2mmol/L[[乙酸]]钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异[[戊醇]]混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

⑤13000r/min离心20min.

⑥轻轻将水相转移到一支新管中.

⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.

⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.

⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,[[真空干燥]].

⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.

⑾ 取10μl RNA样品.

⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV[[逆转录酶]]。

⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.

⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。

由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]可鉴定其特异性。

'''二、PCR扩增步骤'''

（一）[[引物]]的设计与合成

HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV[[基因]]易发生[[变异]]，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。

检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感[[细胞混合]]得到连续的10倍感染细胞的[[稀释液]]。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它[[逆转录病毒]]感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。

已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些[[核苷酸序列]]。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV[[基因组]]序列的[[质粒]]DNA稀释液和2μg载体[[鲱鱼]]精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。

表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及[[探针]]

{| class="wikitable"
| 引物及探针
| 序列（5′3′）
| 基因区
| 片段（bp）
|-
| SK38
| ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT
| gag
| 115(HIV1)
|-
| SK39
| TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
|
|
|-
| SK19(P)
| ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
|
|
|-
| SK145
| AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
| gag
| 141(HIV1)
|-
| SK101
| GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC
|
| 139(HIV2)
|-
| SK102(P)
| GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
|
|
|-
| SK145
| AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
| gag
| 142(HIV1)
|-
| SK150
| TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC
|
| 139(HIV2)
|-
| SK102(P)
| GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
|
|
|-
| O-1
| GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC
| gag
| 525(HIV1)
|-
| O-2
| TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
|
|
|-
| I-2
| TTGGTCCTTGTCTTATGTCC
| gag
| 422(HIV1)
|-
| I-1
| TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
|
|
|-
| GK55
| CCTGCTATGTCACTTCCCCT
| gag
| 190(HIV1)
|-
| GK56
| TTATCAGAAGGAGCCACCCC
|
|
|-
| P-1
| TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT
| pol
| 355(HIV1)
|-
| P-2
| TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
|
|
|-
| SK29
| ACTAGGGAACCCACTGCT
| Itr
| 105(HIV1)
|-
| SK30
| GGTCTGAGGGATCTCTA
|
|
|-
| SK31(P)
| ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
|
|
|-
| P13
| TGGCGCCCGAACAGGGAC
| LTR
| 168
|-
| P14
| TACCCACGCTCTCGCAG
|
|
|-
| SK89
| AGGAGCTGGTGGGGAACG
| LTR
| 165(HIV2)
|-
| SK90
| GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
|
|
|-
| SK91(P)
| TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
|
|
|-
| SK68
| AGCAGCAGGAAGCACTATGG
| env
| 142(HIV1)
|-
| SK69
| CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
|
|
|-
| SK70(P)
| ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
|
|
|-
| CO1
| ACAATTATTGTCTGGTATAG
| env
| 135(HIV1)
|-
| CO2
| AGGTATCTTTCCACAGGCAG
|
|
|-
| CO3(P)
| TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
|
|
|-
| CO71
| TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA
| env
| 320(HIV1)
|-
| CO72
| TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
|
|
|-
| CO75(P)
| GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA
|
|
|}

（二）PCR扩增步骤

1．扩增条件

当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/ldNTP,每100μl反应体积2～4U Taq DNA[[聚合酶]],2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25～30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。

2.扩增的步骤

(1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。

(2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl<sub>2</sub>,16mmol/LDTT)。

(3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。

(4)反应混合物于93℃变性处理7min。

(5)冷却至室温,加入4UTaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。

(6)加入50μl矿物油,离心10s。

(7)置70℃保温5min。

(8)PCR扩增25个循环,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。

PCR检测出现[[假阴性]]的原因有：标本中的HIV-DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR[[假阳性]]的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV-DNA。

'''三、扩增产物的检测和分析'''

扩增产物的检测和分析可采用[[凝胶电泳]]，[[限制性内切酶]]图谱，DNA序列分析及[[分子杂交]]等技术。

（一）凝胶电泳分析

根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的[[分子]]大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。

（二）分子杂交分析

分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶[[位点]]上[[碱基]][[突变]]的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种[[等位基因]]特异性[[寡核苷酸探针]]与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下：

PCR[[扩增技术]]和分子杂交的敏感性。

PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB[[染色]]的电泳[[凝胶]]来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。

'''四、PCR技术在HIV检测中的应用'''

PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和[[病毒学]]标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且[[血清]]阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长[[潜伏期]]（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV-1血清阳性母亲的[[婴儿]]的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。

（一）[[血清抗体]]阳性病人HIV序列的检测

有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞[[培养物]]，[[精液]]细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI[[消化]]。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个[[细胞系]]中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多[[细胞培养]]物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。

从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100%检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64%，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的[[异源性]]，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99%）。

(二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测

由于在感染HIV后到出现[[免疫反应]]之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在[[高危人群]]中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24～39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。

(三)新生儿HIV序列的检测

HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%～60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30～50%的这些新生儿可在母亲的[[子宫]]里,在[[分娩]]和[[引产]]或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何[[症状]].病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV[[抗原]]也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药[[毒性]]大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12～15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的.

PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，[[静脉吸毒]]者和可疑的[[血清反应]]者。PCR技术还可用来检测[[血液制品]]及[[疫苗]]中有无HIV。

'''五、[[艾滋病]]诊断标准：'''

1．[[艾滋病病毒]]抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。

（1）近期内（3-6个月）[[体重减轻]]10%以上，且持续[[发热]]达38℃一个月以上；

（2）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续[[腹泻]]（每日达3-5次）一个月以上。

（3）[[卡氏肺囊虫肺炎]]（PCR）

（4）[[卡波济肉瘤]]KS。

（5）明显的[[霉菌]]或其他条件致病感染。

2．若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时，可为实验确诊艾滋病病人。

（1）CD4/CD8（辅助/抑制）[[淋巴细胞计数]]比值&lt;1，CD4[[细胞计数]]下降；

（2）全身[[淋巴结肿大]]；

（3）明显的[[中枢神经系统]]占位性病变的症状和[[体征]]，出现[[痴呆]]，辩别能力丧失，或[[运动神经]][[功能障碍]]。
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基因诊断与性病/艾滋病诊断 - 版本历史

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