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2014-02-05T14:10:21Z

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（一）[[DNA]][[探针]]

DNA探针是最常用的[[核酸]]探针，指长度在几百[[碱基对]]以上的双链DNA或[[单链DNA]]探针。现已获的DNA探针种类很多，有[[细菌]]、[[病毒]]、[[原虫]]、[[真菌]]、动物和人类[[细胞]]DNA探针，这类探针多为某一[[基因]]的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的[[毒力]]因子[[基因探针]]和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于[[分子克隆]]技术的发展和应用。以细菌为例，目前[[分子杂交]]技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌[[分类学]]的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病[[病原体]]诊断上具有广泛的前景。

DNA探针（包括cDNA探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在[[质粒]]载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，DNA探针不易降解（相对[[RNA]]而言），一般能有效抑制DNA[[酶活性]]。第三，DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如[[缺口平移]]法、随机[[引物]]法、PCR标记法等，能用于[[同位素]]和非同位素标记。

（二）cDNA探针

cDNA是指互补于mRNA的DNA[[分子]]（complementary DNA）。cDNA是由RNA经一种称为[[逆转录酶]]的DNA[[聚合酶]][[催化]]产生的。携带逆转录酶的病毒侵入[[宿主]]细胞后，病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA，并进而整合入宿主细胞[[染色体]]DNA分子，随宿主细胞DNA复制同时复制，这种整合的[[病毒基因组]]称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性，一旦因某种因素刺激而被[[活化]]，则该病毒大量复制。如其带有[[癌基因]]，还可能诱发细胞[[癌变]]。

[[逆转录]]现在已成为一项重要的分子[[生物学]]技术，广泛用于基因的克隆和表达。从[[逆转录病毒]]中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。利用[[真核]]mRNA3′末端存在一段[[聚腺苷酸]]尾，可以合成一段[[寡聚]][[胸苷酸]]用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链，然后再用RNaseH将mRNA[[消化]]掉，再加入[[大肠杆菌]]DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链，即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。

所得到的双链cDNA分子经S1[[核酸酶]]切平两端后接一个有限制酶切点的接头(Adapter),再经特定[[限制酶]]消化产生[[粘性末端]]，即可与含互补末端的载体进行连接。常用的[[克隆载体]]是λ[[噬菌体]]DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含105以上转化子文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有[[内含子]]序列。因此尤其适用于[[基因表达]]的检测。

（三）RNA探针

RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是[[单链]]分子，所以它与靶序列的[[杂交反应]]效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因[[转录]]或[[病毒复制]]过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒[[人类免疫缺陷病毒]]（[[HIV]]）的[[基因组]]DNA克隆时，因无DNA探针可利用，获得HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。

随着体外逆转录技术不断完善，已成功的建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM，这类载体在多克隆[[位点]]两侧分别带有SP6[[启动子]]和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在[[底物]]中加入适量的[[放射性]]或[[生物素]]标记的dUTP，则所合成的RNA可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记分子的利用率。

RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。

（四）[[寡核苷酸探针]]

前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制[[酶谱]]和测序时，也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强，复杂度也高，从[[统计学]]角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少。克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测[[标记基因]]更多。但是，较长的探针对于靶序列[[变异]]的识别能力又有所降低。对于仅是单个[[碱基]]或少数碱基不配的两个序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点，优点是当用于检测病原[[微生物]]时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于检测[[突变]]点。这种情况，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。

合成的寡核苷酸探针具有以下特点：第一，由于链短，其序列复杂度低，[[分子量]]小，所以和等量靶位点完全杂交的时间[[比克]]隆探针短。第二，寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化，因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或[[化学]]方法修饰以进行非放射性[[标记物]]的标记。最常用的寡核苷酸探针长18-40个硷基，目前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。

对于合成的寡核苷酸探针有以下要求：

（1）长度以18-50碱基为宜，较长探针杂交时间较长，合成量也低；较短探针特异性较差。

（2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异杂交。

（3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。

（4）避免单一碱基的重复出现。

（5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较，探针序列应与靶序列核酸杂交，而与非靶区域的[[同源性]]不应超过70%或有连续8个或更多的碱基的[[同源]]。否则，该探针不能用。
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基因诊断与性病/核酸探针的种类 - 版本历史

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