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2014-02-05T14:12:10Z

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[[巨细胞病毒感染]]是[[感染]]人类[[巨细胞病毒]]（human cytomlegalovirus，HCMV）的一种[[全身感染]][[综合征]]。因被感染[[细胞]]变大，核内和胞浆内出现[[包涵体]]，故本病又称[[巨细胞包涵体病]]（Cytomegalic inclusion disease，CID）。[[巨细胞病毒感染症]]可分两种类型，一种是[[唾液腺]][[病毒]]症，是无症状限局性感染，婴幼儿较常见；另一种是全身感染，主要侵犯[[婴儿]]，比较少见。但由于性俗的改变，成人由性行为感染此类病毒在西方国家较为常见，故已归为性传播性[[疾病]]。

==第一节　[[病原学]]==

CMV属于[[疱疹]]病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，其形最大由162个[[壳粒]]（capsomer），正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维[[母细胞]]培养中[[增殖]]，而不能在其他[[动物细胞]]中生长，增殖非常缓慢，初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，[[膨胀]]，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。

CMV在20%[[乙醚]]中最多存活2小时。pH&lt;5时，或置于56℃30分钟，或[[紫外线]]照射5分钟可被充分[[灭活]]。CMV的[[感染性]]对冻融或存于-20℃或-50℃均不稳定，10%的家用[[漂白粉]]可使其感染性明显降低。

==第二节　CMV[[基因组]]结构==

CMVDNA为线性双链[[分子]]，约235-240kb，长度为56-76nm，其[[分子量]]为150-160×103KDa，不同种属的CMv [[DNA]]分子量基本相同。各毒株DNA有80%[[同源]]序列，通过限制性[[酶谱]]可区分不同毒株。CMV与其他疱疹病毒一样，具有1个长的[[单一序列]]（UL）及1个短的单一序列（US）。UL和US的相连处及两端均为DNA[[重复序列]]。UL约115×103KDa，约占16%。UL两端的两个[[反向重复序列]]约占90%；US两端的两个反向重复序列约占2%。由于UL及US可以两种方向存在，则CMv DNA具有4种分子异构型，但除人类巨细胞病毒（HCMV）及鼠CMV外，其它动物CMV无异[[构型]]存在。CMvDNA只有一个单向性的IE[[启动子]][[复合体]]，其可指导多个[[基因]]的表达。CMV基因组至少能编码[[氨基酸残基]]数100以上的[[多肽]]200余种，包括原始[[基因产物]]，中间产物及终未产物。

巨细胞病毒基因组的重复序列对其复制、[[基因表达]]方向以及与细胞相互作用的方式可能有重要意义。用[[核酸外切酶]]处理双链巨细胞病毒DNA可形成[[粘性末端]]而接连成环状，这一特点可能与该病毒的转化作用和潜在的致癌性有关。

==第三节　感染途径==

CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一[[宿主]]。不同国家及不同经济状况[[感染率]]不同。成人CMV感染和[[免疫功能]]有密切关系。如因[[器官移植]]而接受[[免疫抑制剂]]治疗者，常因所供器官和输入[[血液]]中有潜伏病毒，或[[免疫抑制]]使潜伏的病毒[[活化]]而发病，[[艾滋病]]患者的CMV感染[[发病率]]高。

[[传染源]]是病人及其急性带毒者，病毒可由乳汁、[[唾液]]及尿排出，可持续数周到几年，人类易于感染，[[传播途径]]多种多样。属于性传播性疾病。多从[[精液]]，宫颈分泌物，泪液及粪便（[[口腔]]性欲，吻肛）感染所致。（见表1）

[[同源性]]CMV感染是[[输血]]和器官移植的一种严重危害，多次输血或一次大量输血使原发和再发感染的危险性增高，输入含[[白细胞]]血液的危险性更高，器官或[[骨髓移植术]]后CMV感染率也高。

CMV感染途径（环）表表1

{| cellspacing="4" cellpadding="1" align="center"
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{{图片|glnotvht.jpg|}}
|-
| align="center" valign="top" |
|}

第四节　发病机理

初次感染后，CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官，[[尸检]]提示肺、肝、胰、唾液腺、[[中枢神经系统]]及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度，与缺乏产生沉淀[[抗体]]的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后，在外周血中出现具有[[抑制细胞]]毒[[表型]]的活化T[[淋巴细胞]]，如果宿主的T细胞功能受损，潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。[[组织移植]]后发生的慢性刺激，为CMV活化，诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂如[[抗胸腺细胞球蛋白]]，与临床CMV症候群高发率有关。此外，CMV在功能上可作为辅助因子，使潜伏感染的[[HIV]]活化。

==第五节　[[免疫学]]==

CMV感染可引起机体的免疫功能降低，特别是[[细胞免疫]]功能下降。CMV感染对[[胸腺]]发育及[[脾细胞]]、[[单核吞噬细胞]]、NK细胞及CTL细胞的功能有着显着的影响。

'''一、对胸腺、[[脾脏]]的影响'''

实验室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺发育受抑，T细胞数减少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可检出CMV。

CMV感染致脾功能受影响，脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降，脾细胞产生的IL-2显着降低。

'''二、对[[免疫细胞]]的影响'''

CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的[[单核细胞]]中复制，其中单核吞噬细胞最易感染CMV，淋巴细胞在[[免疫反应]]中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后，可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。

CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周[[血淋]]巴细胞对[[有丝分裂]]原、CMV[[抗原]]和HSV抗原增殖反应减弱，诱导[[干扰素]]水平下降，CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月，大多数患者T细胞[[亚群]]比例仍未完全恢复正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被[[病毒感染]]的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV[[免疫]]中起着枢纽作用，不但可以直接吞噬、杀伤病毒，更重要的是可以处理、提呈抗原，[[分泌细胞]]因子，调控和扩大免疫反应。当CMV感染后，单核吞噬细胞功能受到影响，CMV感染[[巨噬细胞]]引起其吞噬功能降低，细胞内[[氧自由基]]产生减少，FC[[受体]]、[[补体受体]]的表达发生改变，且其抗原提呈功能降低，产生IL-1降低，对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用[[胸腺细胞]]增殖试验检测，IL-1活性降低，IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。

NK细胞有[[拮抗]]CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程，但存在高的NK活力不一定是保护性应答，而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止[[原发性]]CMV感染的出现，但一旦存在感染后，NK细胞能在CMV感染早期出现，有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞是抗CMV的重要[[效应细胞]]。在CMV复制早期，感染性病毒体产生前，它们能裂解感染细胞，使病毒在细胞间扩散[[流产]]。在小鼠模型中，病毒作用了3-5天时，抗病毒效应由NK细胞介导，NK细胞活性可由IFN增强。6-21天，脾、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时，NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外，特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染[[肾移植]]受者T细胞应答，发现有14个有CMV[[细胞毒]]应答，而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此，特异性T细胞存在，有阻止CMV感染再发的作用。

'''三、抗体有降低CMV感染的[[毒力]]作用'''

机体受CMV的感染后，可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有[[特异性抗体]]出现，包括[[中和抗体]]。但仍能检出CMV，说明抗体并不能阻止病毒扩散。[[胎儿]]从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明，致死性CMV攻击前，在小鼠腹腔或[[静脉]]注入0.2ml高效价抗CMV[[球蛋白]]，可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击，动物仍全部存活，表明抗体有降低CMV的毒力作用。

==第六节　[[临床表现]]==

CMV感染的自然史很复杂，在原发性感染以后排毒，往往持续数周、数月甚至数年，然后感染转为潜伏。常有复发感染伴重新排毒。甚至在原发感染后很多年，潜伏病毒再激活，也可能有不同[[抗原性]][[病毒株]]的再感染。CMV感染的临床表现与个体免疫功能和年龄有关。从表2所示，不论从[[垂直感染]]、平行传播或[[医源性感染]]所出现的[[症状]]与[[体征]]都是多种多样的。

表2　CMV[[感染症]][[临床经过]]与病型（Baerlocher等）

{| class="wikitable"
| 1.新生儿感染（先天性） a.重症型：[[黄疸]]、[[贫血]]、[[肝脾肿大]]、[[血小板减少性紫癜]]，侵犯中枢神经，[[肺炎]]，[[心肌炎]]） b.轻症型：[[假死]]，[[心脏肥大]]，高[[胆红素血症]]
|-
| 2．出生后[[无症状期]]，乳儿期再感染CMV（先天性/后天性？） a.全身型 b.[[呼吸]]系型（[[百日咳]]样）c.肝脾肿大 d.胃肠型 e.肾型？ 3．后天型 a.[[流感]]型 b.[[单核细胞增多症]]型 c.呼吸系型 d.胃肠型 e.[[肝炎]] f.因特殊医疗防御能力低下 g.无症型？
|-
| 4．1、2、3项的后果即精神、运动[[发育迟缓]]
|}

关于后天性CMV感染症，在临床中常见于输血后的单核细胞增多症，由于免疫功能缺陷而发生[[血管]]、[[网膜炎]]、肺炎以及[[消化道感染]]。并且大多数患者合并格-巴氏综合征。

==第七节　诊断==

单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床[[标本]]中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续[[抗体滴度]]升高，将有助于诊断。

一、病毒分离

最好用唾液、尿液、[[生殖]]道分泌物、乳汁和白细胞，[[接种]]到人的[[成纤维细胞]]内繁殖和分离，细胞病变效应（CPE）在1天或数周后出现，经固定和HE[[染色]]后可观察到[[巨细胞]]，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或[[多克隆抗体]]的荧光染色等方法检查。

二、[[血清抗体]]检测

最常用的有[[补体结合试验]]（CF）、间接免疫荧光试验（IIF）、免疫酶试验（EIA）、[[间接血凝试验]]（IHA）和放射免疫试验（RIA）等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份[[血清标本]]已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。

三、DNA[[探针]]

已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。

四、[[聚合酶链式反应]]（PCR）

（一）标本的采集及处理

采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的[[血沉]]棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。

尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集[[上清液]]。由于尿液中含有PCR[[抑制剂]]，因此需用[[聚乙二醇]]（PEG6000）进行[[预处理]]：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于[[蒸馏水]]中。该悬液可直接用于PCR[[扩增]]；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。

（二）模板DNA的制备

1．由[[血液标本]]制备模板DNA

方法A：向[[血清]]中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。

方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。②加入500μl 6mol/L[[盐酸]]胍，[[匀浆]]。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl [[蛋白酶]]K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。④加入1130μl 的[[乙醇]]，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA中。置4℃备用。

2.由冰冻组织标本制备模板DNA：①用恒冷[[切片机]]切取一块～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。②加入10%用[[缓冲液]]配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl）；将沉淀捣碎。福马林固定的或[[石蜡]]包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。

3.由尿液标本制备模板DNA：①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/LNaCl和20μl 玻璃粉悬液（DNa PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。

（三）[[引物]]及探针

引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期[[蛋白]]基因的启动子区和开始的4个[[外显子]]序列、晚期抗原gp64基因以及[[磷酸]]化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。

（四）PCR扩增步骤

1．10×反应缓冲液：100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/l KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml[[明胶]]。

Taq DNA [[聚合酶]]：5U/μl 。

10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常规PCR扩增

10×反应混合物（50μl）反应缓冲液 5μl

10×dNTP　5μl

模板DNA　5μl

Taq DNA聚合酶　0.2μl (IU)

引物各0.5μl

蒸馏水 3.8μl

加1～2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。

表3　CMV PCR扩增所用的引物及探针

{| class="wikitable"
| 引物及探针
| 序列（5′→3′）
| 位置
| 片段大小
|-
| IE1
| CCACCCGTGGTGCCAGCTCC
| 早期基因
| 159（bp）
|-
| IE2
| CCCGCTCCTCCTGAGCACCC
|
|
|-
| IE3（探针）
| CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC
|
|
|-
| LA1
| CCGCAACCTGGTGCCCATGG
| 晚期gp64
| 139
|-
| LA2
| CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG
|
|
|-
| LA3（探针）
| TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG
|
|
|-
| IE1a
| AGATCGCCTGGAGACGCCAT
| 早期外显子1
| 139
|-
| IE1b
| GGAATCCGCGTTCCAATGCA
|
|
|-
| IE2a
| ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG
| 早期外显子2
| 72
|-
| IE2b
| CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
|
|
|-
| IE3a
| GTGACCAAGGCCACGACGTT
| 早期外显子3
| 167
|-
| IE3b
| TCTGCCAGGACATCTTTCTC
|
|
|-
| IE4a
| ACAGATTAAGGTTCGAGTGC
| 早期外显子4
| 179
|-
| IE4b
| CAATACACTTCATCTCCTCG
|
|
|-
| IE4c
| TTACCAAGAACTCAGCCTTC
| 早期外显子4
| 158
|-
| IE4d
| GTGCGTGAGCACCTTGTCTC
|
|
|-
| IE4e
| TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA
| 早期外显子4
| 426
|-
| IE4f
| ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG
|
|
|-
| Pp1a
| TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT
| Pp71基因
| 316
|-
| Pp1b
| ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC
| Pp71
|
|}

3．套式（nested）PCR扩增：①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他[[试剂]]。然后，于94℃60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。

（五）产物鉴定

扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。

1．固相杂交：

① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%[[甲酰]]胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。②加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④自显影。

2．液相杂交及电泳分析：

① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。②加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L[[磷酸钠]]及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%[[聚丙烯酰胺凝胶]]中进行电泳。⑤电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对[[X线]]片曝光，自显影。

HCMV DNA分子很大，其[[碱基]]序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的[[限制性内切酶]]片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。

在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR[[反应时]]常导致一定水平的[[本底]]产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的[[假阳性]]。这种方法也可避免产生[[假阴性]]结果。

PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的[[组织培养]]上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性[[寡核苷酸探针]]进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMv DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个[[病毒基因组]]即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。

PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或[[血清学]]证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过[[胎盘]]内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的[[新生儿死亡率]]较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对[[优生优育]]也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中[[供体]]是否为HCMV与许多严重[[病症]]的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种[[抗病毒药物]]疗效的手段。

==第八节　治疗==

巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的[[免疫球蛋白]]制剂、干扰素及[[转移因子]]等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种[[活疫苗]]，初试后颇见效。一种是由AD169[[菌株]]研制成的；另一种是从TOWn菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，CMV抗体升高，导致免疫功能增强。
==参看==
*[[巨细胞病毒感染症]]
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基因诊断与性病/巨细胞病毒感染症 - 版本历史

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