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2014-02-05T14:10:50Z

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[[梅毒螺旋体]]不能进行体外培养。检测临床[[标本]]中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔[[感染]]试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋体常用的标准方法。然而用RIT对[[新生儿]]或成人[[梅毒]]进行常规诊断不切合实际。梅毒的[[血清学诊断]]对确定感染及治疗很有意义，但对[[早期梅毒]]诊断不敏感，对先天性及[[神经]]性梅毒的诊断不够特异。[[血清学]]试验用作[[先天性梅毒]]的辅助诊断，其首要问题是将无症状感染[[婴儿]]从非感染婴儿区别开来，这些婴儿的母亲梅毒血清试验阳性，困难在于不能将母亲[[体液免疫]]反应同婴儿的[[抗体反应]]相区别，因为母亲的IgG可传递给[[胎儿]]。另外由于IgG终身存在，所以很难评价治疗结果。血清学诊断常常又存在着[[假阳性]]。

PCR检测梅毒螺旋体[[DNA]]，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。

（一）PCR[[引物]]的设计部位与序列：

目前有四套[[扩增]]梅毒螺旋体DNA的系统：扩增47KDa膜[[抗原]][[基因]]（tpp47基因），扩增39KDa碱性膜蛋白基因（bmp基因），扩增TpF1[[蛋白]]基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和扩增tmpA基因。

三种扩增系统的引物序列：

47-1CACAATGCTCACTGAGGATAGT648-669

47-2ACGCACAGAACCGAATTCCTTG1284-1035

Tpp47-3　TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC713-734

47-4TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT　 1187-1208

[[TP]]3　CAGGTAACGGATGCTGAGT　256-275

TP4　CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741

bmpTP5（[[探针]]） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519

TP7　CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191

TP8　AACGCCTCCATCGTCACACC　788-769

F1　 CTCTTCAAGGAGCTCAT222-206

Tpf-1F2　 AGACAGTGGTTATGCTc 　 77-61

或tyf-1F3(探针)ATTGCGCCAGCATGTAG　 114-130

F4（探针）ATTGCGCCGGCATGTAG　 114-130

（二）操作方法

1．[[采集标本]]，根据病人的情况可采取局部分泌物，抽取[[淋巴结]]液，[[羊水]]，[[血清]]，[[脑脊液]]。用适量的[[蒸馏水]]稀释，保存于4℃冰箱。

2．标本处理：目的是为了暴露梅毒螺旋体的DNA，消除标本对PCR的抑制物。采用下列处理方法。

①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量[[离心管]]中，水浴煮10min后在冰浴中冷却，13000g离心10s，上清用作PCR分析。

②低速离心法：将100μl羊水，血清或脑脊液加入到900μl[[无菌]][[磷酸]][[缓冲液]]中，10000g室温离心10min，上清转入另外的微量离心管中，20000g4℃离心1h，弃上清，沉淀悬浮于50μl 无菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷却，取40μl上清作PCR。

③碱裂解法：取收集标本100μl加于含1mol/lNaCl,1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min,用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl(pH8.0)中和。用相同体积的[[苯酚]]抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整个600μl的溶液用相同体积的[[氯仿]]：异[[戊醇]]（24：1）抽提，然后用相同体积的[[异丙醇]]沉淀（-20℃过液）。13000g4℃离心15min，轻轻倒出上清，凉干。沿淀悬浮于51μl无菌水中，取20μl作PCR模板。

（三）PCR扩增

1．扩增47KDa膜抗原基因:100ml反应物含：10mmol/l TrisHCl(pH8.3),50mmol/L KCl，3mmol/LMgCl2,100μg/ml[[明胶]]，0.5μg引物(47-1和47-2),75mmol/LdNTPs,2.5u TaqDNA[[聚合酶]]。取不同量各种制备的DNA作模板,反应过程:94℃15s，60℃1min,72℃1min,循环40次,末次循环增加72℃10min延伸时间,取10ml反应物用1%[[琼脂糖凝胶电泳]]分析。点杂交分析产物：取10mlPCR扩增产物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中变性10min,用380μ11.5mol/l NaCl-1mmol/L Tris(pH7.2)中和,然后用Minifold I点膜,80℃[[真空]]处理膜2h,用496bp探针65℃杂交过夜。探针为引物47-3和47-4的PCR产物,用随机引物法标记.

2．扩增39KDa碱性膜蛋白基因:25μ1反应体系含:1×RT缓冲液,50mmol/lTris-HCl(pH8.5),50mmol/LNaCl,4mmol/LMgCl2,2mmol/L DTT(二硫基苏糖醇),200μmol/l dNTP,100μmol/L引物(TP7和TP8)，0.01%[[牛血清]][[白蛋白]](无DNase和RNase),1UTaqDNA聚合酶,5μ1样品,可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增强PCR。

PCR1:先用引物TP7和TP8扩增出617bp片段,反应过程:94℃3min后进入循环过程:94℃1min,65℃1min,72℃1min,循环数为30或35,每一循环中72℃延伸递增5s,最后一次延伸时间延长到6min.

PCR2:再用巢居引物TP3和TP4扩增出500bp片段,PCR1产物用蒸馏水稀释10倍,取5μ1用作第二次扩增.PCR2中MgCl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4),其它条件与PCR1相同。

PCR产物分析。①取10μ1反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳；②Southern印迹后,用[[寡核苷酸探针]]TP5(以32P作[[末端标记]])杂交。

3．扩增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因:100μ1反应物含:50mmol/l KCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2,0.2mg/ml明胶,1μmol/ldNTP,2mmol/L引物(F1和F2),2.5UTaqDNA聚合酶,10μ1经处理的兔[[睾丸梅毒]][[螺旋体]]悬液,反应过程:94℃1min,55℃ 1.5min,72℃ 2.5min,循环40次，取10μ1PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹后,用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异物的探针F4分别杂交。

为使扩增效率达到最大，反应参数应选择最佳数值。使用大片段双股DNA探针检测PCR产物，而不用合成的寡核苷酸探针,因为这样可通过标记得到较高、特异的放射活性。另外，大片段探针能最大减少[[野生株]]tpp47可变序列的[[假阴性]]结果及由于Taq DNA聚合酶的错误导致[[碱基]]替代的假阴性结果。实验证实：PCR的敏感性确能达到检测单一tpp47拷贝的水平。

由于临床标本可能含有大量人[[细胞]]和[[微生物]]，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的。尽管大量数椐支持47Da膜抗原基因及其相应基因具梅毒螺旋体特异性，还应深入研究该方法的特异性。在EB[[染色]]的[[琼脂糖]]凝胶偶而可见非特异的PCR产物，（如扩增[[淋病]]奈氏[[球菌]]）时就需要用tpp47特异的探针杂交来增加特异性及敏感性。仅从梅毒螺旋体梅毒[[亚种]]和雅司亚种[[染色体]]DNA获得了特异的PCR产物，表明了病原性螺旋体非常相近的[[亲缘关系]]及47Da[[免疫]]蛋白高度保守的[[抗原性]]。扩增tpp47不能如常规法那样能区分梅毒螺旋体和[[伯氏疏螺旋体]]，在用血清学试验诊断梅毒和莱姆[[疾病]]时，这两种螺旋体有[[交叉反应]]。

梅毒螺旋体梅毒亚种tpf-1基因在123位置为A，[[雅司]]亚种tpf-1基因在123位置为G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特异的寡核苷酸探针（两种探针仅一个[[核苷酸]]不同）检测不同[[菌株]]tpf-1或tpf-1基因的扩增产物。结果表明：不能根据tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同来区别梅毒亚种。这些菌种从梅毒患者分离，一些已用兔[[传代]]多次，通过对新鲜临床标本中梅毒螺旋体DNA的分析比较，以上结果可能是由于梅毒螺旋体在传代中点[[突变]]所致。
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