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2014-02-05T10:31:00Z

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（1）特异正常[[基因]]的分离与克隆：应用[[重组DNA]]和[[分子克隆]]技术结合[[基因定位]]研究成果，已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆，这是[[基因治疗]]的前提，在当代[[分子]][[生物技术]]条件下，一般来说，只要有[[基因探针]]和准确的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，现在既可人工合成[[DNA]][[探针]]，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因，这些都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。

（2）[[外源基因]]的转移：[[基因转移]]（gene transfer）是将外源基因导入细胞内，其转移方法较多，常用的要有下列几类：

1）[[化学]]法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和[[磷酸钙]]、DEAE－[[葡萄糖]]或与若干[[脂类]]混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入[[培养基]]中与[[细胞]]接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些[[化合物]]可扰乱[[细胞膜]]，故可将DNA输入细胞内，并整合于[[受体]]细胞的[[基因组]]中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可[[传代]]。这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。

2）[[物理]]法：包括[[电穿孔]]法和直接[[显微注射]]法。

①电穿孔法：电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于[[高压]]脉冲电场中，通过[[电击]]使细胞产生可逆性的[[穿孔]]，周围[[基质]]中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。

②显微注射法：显微注射（microinjection）是在[[显微镜]]直视下，向[[细胞核]]内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于[[生殖细胞]]时，有效率可达10％。直接用于[[体细胞]]却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为[[转基因动物]]，目前成功使用得较多的是[[转基因小鼠]]（transgenic mice），它可作为繁殖大量后代的[[疾病]]动物模型。

③[[脂质体]]法：脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与[[靶细胞]]融合，或直接注入病灶组织，使之表达。

3）[[同源重组]]法：同源重组（homologous recombination）是将外源基因定位导入受体细胞的[[染色体]]上，在该座位因有同源序列，通过单一或[[双交换]]，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有[[新霉素]]（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的[[细胞死亡]]。对于[[体细胞基因治疗]]，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术，提高[[重组率]]，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。

4）[[病毒]]介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移（viral mediatedgene transfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector）,将外源目的基因通过[[基因重组]]技术，将其组装于病毒上，让这种[[重组]]病毒去[[感染]]受体[[宿主]]细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。

①[[反转录病毒]]载体：反转录病毒虽是[[RNA]]病毒，但有[[反转录酶]]，可使RNA[[转录]]为DNA，再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力，可使近100％的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染[[广谱]]动物[[物种]]和细胞类型而无严格的[[组织特异性]]；再者随机整俣的病毒可长期存留，一般无害于细胞，但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有[[病毒蛋白]]及[[癌基因]]，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将[[病毒基因]]及其癌基因除去，仅留它们的外壳[[蛋白]]，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defective virus）。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的，所以还是可能激活细胞的[[原癌基因]]，以及因随机插入发生插入[[突变]]。

在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠[[白血病病毒]]（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工构建的结构如图14-1。

②DNA病毒介导载体（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括[[腺病毒]]、SV40、[[牛乳]]头[[瘤病]]毒、[[疱疹病毒]]等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒，实用意义不大，但

{{图片|gv21hllv.jpg|Mo-MLV结构示意图}}

图14-1 Mo-MLV结构示意图

LTR：[[长末端重复序列]]，内含[[启动子]]、[[增强子]]及有关调节顺序；gag：病毒[[核心抗原]]基因；

env：[[病毒外壳蛋白]]基因；pol：反转录酶基因

牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体中引起插入突变，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出[[基因产物]]。有人发现，因缺少[[E1]]区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、[[肝内胆管]]和[[肌肉]]组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向。图14-2是人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中，感染细胞经培养后再输入病人进行治疗的模式图。

{{图片|gv21ho7s.jpg|人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中感染细胞}}

图14-2　人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中感染细胞

经培养后再输入病人体内进行治疗模式图

最近，美国设计了一个的[[腺病]]症载体（图14-3），它是用一个化学连接器即[[赖氨酸]]链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个[[表面抗体]]而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新[[病毒载体]]称为腺病毒多赖氨酸DNA[[复合体]]（adeno virus-polylysine DNA-complex）。

{{图片|gv21hi33.jpg|腺病毒赖氨酸DNA复合体}}

图14-3 腺病毒赖氨酸DNA复合体

采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对[[神经细胞]]、[[心肌细胞]]等[[基因缺陷]]的纠正有特殊意义；②病毒颗粒相对稳定，并易于[[纯化]]和浓缩，且感染力不降低；③可有效[[转导]]多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C[[亚群]]，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功[[地运]]载48000bp的基因，而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。
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