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2014-02-05T10:20:34Z

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[[病毒感染]]的[[实验室检查]]包括[[病毒]]分离与鉴定、病毒[[核酸]]与[[抗原]]的直接检出以及[[特异性抗体]]的检测。临床医师根据流行病学资料，[[疾病]]的[[症状]]与[[体征]]综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的[[标本]]送检。

== 一、检材的采集与送检==

[[病毒性疾病]]通常采集[[血液]]、[[鼻咽]]分泌液、咯痰、粪便、[[脑脊液]]、[[疱疹]]内容物、活检组织或[[尸检]]组织等。

供分离病毒、检出核酸及抗原的标本的，要求：

（一）尽早采取在发病初期（[[急性期]]）采取，较易检出病毒，越迟阳性率越低。

（二）部位适宜由[[感染]]部位采取，如[[呼吸道感染]]采取鼻咽洗漱液或咯痰；肠道[[感染]]采取粪便；脑内感染采取脑脊液；[[皮肤感染]]采取病灶组织；有病[[毒血症]]时采取血液。

（三）冷藏速送病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得检材应尽快送检。若距离实验室较远，应将检材放入装有冰块或干冰的空器内送检。病变组织则应保存于50%的[[甘油]]缓冲盐水中。污染检材，如鼻咽分泌液、粪便等应加入[[青霉素]]、[[链霉素]]或庆[[大毒]]素等，以免杂菌污染[[细胞]]或鸡胚，而影响病毒分离。

检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期[[双份血清]]，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后2～3周采取。[[血清标本]]放4℃-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及[[补体]]。[[无菌]]性[[脑炎]]患者也可取脑脊液检测特异性lgM。

表23-1 病毒检材采集与检验结果的关系

{| class="wikitable"
|-
| | 采取标本的时期
| | 检查病毒及其成分
| | 测定[[抗体]]
|-
| | [[潜伏期]]及[[前驱期]] 刚发病或急性期 恢复期及[[康复]]期
| | 较难查见 最多查见 很难查见
| | 未增多 未增多或增多不明显 明显增多（常超过4倍）
|}

 

表23-2 供病毒分离的检材

 

{| class="wikitable"
|-
| | [[临床表现]]
| | [[常见病]]毒
| | 帮助诊断有用的检材
|-
| | 呼吸道感染
| | [[腺病毒]] [[巨细胞病毒]] [[流感病毒]] 副流感病毒 呼肠孤病毒 合胞病毒
| | 咽试、肛拭 咽试或[[含漱液]]、尿液 咽拭或含漱液 咽拭含漱液 咽拭、粪便或肛拭 咽拭或含漱液、鼻咽洗液
|-
| | 出疹疾病
| | [[柯萨奇病毒]] 巨细胞病毒 [[埃可病毒]] EB病毒 [[单纯疱疹病毒]] [[麻疹病毒]] [[风疹病毒]] [[水痘带状疱疹病毒]]
| | 粪便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 粪便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液 病灶棉拭或吸取液、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 咽洗液、鼻咽拭 病灶棉拭或吸取液、咽拭
|-
| | 脑炎
| | [[虫媒病毒]] 单纯疱疹病毒 麻疹病毒 [[脊髓灰质炎病毒]]
| | 血液、脑脊液 [[脑活检]]、脑脊液、疱疹棉拭或吸取液 脑脊液、咽拭或含漱液、尿液 粪便或肛拭、咽拭、脑脊液
|-
| | 无菌性[[脑膜炎]]
| | 柯萨奇病毒 埃可病毒 [[腮腺炎病毒]]
| | [[脑脊髓]]液、粪便或肛拭、咽拭 脑脊液、粪便或肛拭、咽拭 脑脊髓液、口[[颊粘膜]]棉拭
|-
| | 失天或[[新生儿]]感染
| | 巨细胞病毒 风疹病毒 单纯疱疹病毒
| | 尿液、咽拭或含漱液 咽拭或含漱液、尿液 病灶棉拭或吸取液、回拭
|-
| | 眼部感染
| | 腺病毒 单纯疱疹病毒
| | [[结膜]]棉拭、咽拭、肛拭 结膜棉拭、病灶棉拭或吸取液、咽拭
|-
| | 其它感染 [[巨细胞]]包涵体疾病 [[单核细胞增多]][[综合征]] [[心包炎]]、[[心肌炎]]
| | 巨细胞病毒 巨细胞病毒 EB病毒 [[柯萨奇]]B病毒 埃可病毒
| | 尿液、咽拭 尿液、咽拭 咽拭或洗液 [[心包]]液、粪便、咽拭 心包液、粪便、咽拭
|}

== 二、病毒的分离与鉴定==

'''（一）病毒的分离'''

病毒分离的一般程序是：

{| class="wikitable"
|-
| | 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→[[接种]]
| | 易感的动物→出现[[病状]] 鸡胚→病变或死亡 [[细胞培养]]→细胞病变
| | →鉴定病毒种型([[血清学]]方法)
|}

 

无菌标本(脑脊液、血液、[[血浆]]、[[血清]])可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经[[培养液]]洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用[[抗生素]]处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎[[牛血清]]）、[[葡萄糖]]、[[氨基酸]]、[[维生素]]的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 [[原代细胞培养]](Primary cell culture)用[[胰蛋白酶]]将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在[[培养瓶]]底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为[[二倍体细胞]]，可用于产生病毒[[疫苗]]，如兔肾细胞生产[[风疹疫苗]]，鸡[[成纤维细胞]]产生[[麻疹疫苗]]，猴肾细胞生产脊液[[灰质]]炎疫苗。因原代细胞不能持续[[传代培养]]，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune)原代细胞只能传2-3代细胞就[[退化]]，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持[[染色体]]数为[[二倍体]]，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是[[胚胎]]组织的成纤维细胞（如WI-38[[细胞系]]）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基[[亚砜]]中，大量分装[[安瓿]]贮存于液氮（-196℃）内，做为“种子”，供以后[[传代]]用。目前多用[[二倍体细胞系]]制备病毒疫苗，也用于病毒的[[实验室诊断]]工作。 传代细胞培养 (Continous cell culture)通常是由[[癌细胞]]或二倍体细胞[[突变]]而来（如 Hela 、Hep-2、 Vero细胞系等），染色体数为[[非整倍体]]，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。 表23-3 病毒[[增殖]]用部分细胞系及来源

 

{| class="wikitable"
|-
| | 细胞系名称
| | 来源
|-
| | 二倍体细胞系 HDCS MRC-9 WI-38 传代细胞系 Hela Hep-2 Vero BHK
| | 人胚肺细胞 人[[宫颈癌]]细胞 人上皮细胞 猴肾细胞 [[地鼠肾]]细胞
|}

[[淋巴细胞]]培养（Lymphocyte culture）正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T[[细胞生长因子]]（IL-2）后可在体外培养，为研究人类[[逆转录病毒]]（[[HIV]]、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞[[培养物]]中增殖形成[[多核]]巨细胞。

2．[[动物试验]]这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或[[静脉]]，例如嗜[[神经病]]毒（脑炎病毒）接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠（一周龄）腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变[[组织剪]]碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。

3．鸡胚培养用[[受精]]孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚[[绒毛]][[尿囊]]膜、尿囊腔、[[羊膜]]腔、[[卵黄囊]]、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或[[羊水]]、尿囊液出现[[红细胞凝集]]现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养；但很多病毒在鸡胚中不生长。

'''（二）分离病毒的鉴定'''

1．病毒在细胞内增殖的指征

（1）细胞致病作用(Cytopathogeniceffect,CPE)病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学[[倒置显微镜]]下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断（表23-4）。[[免疫荧光]]（IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被[[荧光素]]标记的特异性抗体着色，在[[荧光显微镜]]下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。

表23-4 病毒在细胞内增殖的指征

{| class="wikitable"
|-
| | 病毒
| | 增殖指征
|-
| | CPE病毒 小[[RNA]]病毒 单纯疱疹病毒 腺病毒 [[副粘病毒]] HIV 非CPE病毒 正粘病毒 副粘病毒 风疹病毒 [[鼻病毒]]
| | 细胞园缩、单层破坏 细胞肿大变园 细胞变园堆积成[[葡萄]]状 多核巨细胞（[[合胞体]]） [[红细胞]]吸附现象 干扰并阻止其他病毒（如ECHO病毒）的细胞致病作用
|}

（2）红细胞吸附现象（Hemadsorptionphenomenon）流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时，以[[细胞膜]]上出现病毒的[[血凝素]]，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的[[抗血清]]，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

（3）干扰现象(Interference phenomenon)一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入[[宿主]]细胞不再生产CPE。

2．病毒感染性的定量测定

空斑形成单位 (Plaque-forming unit ,PFU)测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个[[感染性]]病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用[[中性红]]等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的[[滴度]]可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。

（2）50%[[致死量]]（[[LD]]50）或50%组织细胞感染量（TCID50）的测定本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或[[组织培养]]后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍[[连续稀释]]，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有[[血凝]]特性，或易感动物发病而死亡等，经[[统计学]]方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

3．病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和[[纯化]]后，借助磷钨酸[[负染]]及[[电子显微镜]]可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子[[生物学]]技术分析病毒核酸组成、[[基因组]]织构、序列[[同源性]]比较加以鉴定。

4．[[血清学鉴定]]用已知的诊断血清来鉴定。[[补体结合试验]]可鉴定[[病毒科]]属；[[中和试验]]或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检材中分离出[[病毒株]]，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、[[隐性感染]]或潜伏病毒的混淆，须用病人急性期与恢复期双份血清作血清学试验，[[血清抗体]]滴度有≥4倍以上增高，才有意义。

== 三、病毒核酸及抗原的直接检出==

'''（一）直接检出病毒核酸'''

1．标本滴加到[[硝酸]]纤维素膜上，病毒[[DNA]]结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股核酸按硷基到补原则结合成双股，经[[放射自显影]]，阳性结果出现斑点状杂交信号。含[[轮状病毒]]的[[粪便标本]]经热变性处理，点到膜上，使用轮状病毒体外[[转录]]的放射标记[[探针]]做[[斑点杂交]]，敏感性高于ELISA。[[肠道病毒]]也可用互补的DNA探针做斑点杂交。

目前核酸[[分子杂交]]不但用来检测急性病人标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢性感染、潜伏感染、整合感染病人标本中的病毒DNA。

2．[[多聚酶]]链反应(Polymerase chain reaction, PCR) 一种体外[[基因扩增]]法。先将待检标本DNA[[热变性]]为单股DNA做为模板，加一对人工合成的与模板DNA两端各20个硷基互补的[[引物]]，在耐热DNA多聚酶作用下，使四种[[脱氧核苷]]按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA链，经20～40个循环，可使1个拷贝的核酸[[扩增]]至106以上，经[[琼脂糖]]电泳，可见到溴化乙锭[[染色]]的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸杂交敏感、快速，已用于[[肝炎]]、[[AIDS]]、疱疹病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景。

'''（二）直接检测病毒抗原'''

1．免疫荧光（IF）技术如前所述IF可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。直接[[免疫荧光技术]]是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异性抗体结合，从而间接识别抗原。可取[[咽喉]]脱落细胞，检测[[呼吸道]]合胞病毒、[[流感]]及副[[流感病毒抗原]]；取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯疱疹病毒抗原；取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。近年来使用[[单克隆抗体]]大大提高了检测的灵敏度和准确性。

2．[[免疫]]酶法（IEA）原理与应用范围同免疫荧光技术，IEA是用酶（通常是[[过氧化物酶]]）取代荧光素标记抗体，酶[[催化]][[底物]]形成有色产物，在普通[[光学显微镜]]下清晰可见，不需荧光显微镜，便于推广使用。

3．[[放射免疫测定法]]（RIA）有竞争RIA和因相RNA二种方法。竞急RIA是[[同位素标记]]的已知抗原与标本中未标记的待检[[抗原竞争]]性结合特异性抗体的试验，将形成的[[复合物]]分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与[[系列稀释]]的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检抗原的浓度。因相RIA是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入[[放射性标记]]的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于测定粪便中[[甲肝病毒]]、[[轮状病毒抗原]]及血液中[[乙肝病毒]]抗原。

4．[[酶联免疫吸附试验]]（ELISA）先将特异性抗体包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接触[[放射性物质]]，已被多数实验室采用。

此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或[[免疫电镜法]]直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状病毒、乙肝病毒。

== 四、特异性抗体的检测特异性抗体的检测==

病毒感染后通常诱发针对病毒一种或多种抗原[[免疫应答]]，特异性抗体[[效价]]升高或lgM抗体出现有[[辅助临床诊断]]的价值。

'''（一）补体结合试验（CF''''''）''' CF分二个阶段：1.抗原与抗体（一个为已知，一个为待检）混合，加入定量补体，若抗原与抗体相对应，则补体被消耗；2.在上述混合物中加入[[溶血素]][[致敏]]的绵羊红细胞，若补本已与[[抗原抗体复合物]]完全结合，没有剩补体存在，那么绵羊红细胞不会[[溶血]]，结果为阳性，说明待检标本中有特异性存在，出现阳性结果时血清标本最高稀释度为抗体的效价。反之为阴性结果。由于[[补体结合]]抗体产生早，消失快，适于诊断病毒近期感染。（表23-5）。

{| class="wikitable"
|-
| rowspan="2" | 取血时期
| colspan="7" | 血清稀释倍数及试验结果
| rowspan="2" | [[抗体效价]]
|-
| | 1：2
| | 1：4
| | 1：8
| | 1：16
| | 1：32
| | 1：64
| | 1：128
|-
| | 发病2～3内血清 发病2～3周后血清
| | + +
| | + +
| | + +
| | - +
| | - +
| | - -
| | - -
| | 1：8 1：32*
|}
*此例的抗体效价升高4倍，有诊断意义。

'''（二）中和试验（NT）'''在活体或活细胞内测定病毒被特异性抗体中和、而失去致病力的试验。试验时：①须先测出病毒的[[半数致死量]]（LD50）或半数感染量（ID50）；②随即取活病毒与被试血清按不同比例混合，放置1～2小时让其充分中和；③将病毒与血清混合液注入各组动物、鸡胚或组织细胞培养管内培养；④根据动物、鸡胚死亡数或细胞病变的管数，计算出百分比（%），然后再计算这些试验对象中的半数免于死亡或免于致病所需要的最少量血清（或最大量的病毒），就是该血清的[[中和抗体]]效价（称为50%终点的中和效价）。诊断病毒性疾病时，须取病人双份血清同时做对比试验，病后血清的中和抗体效价也必须超过病初血清4倍以上，才能确诊（表23-6）。用此法鉴定病毒时，须将病毒分别与[[免疫血清]]及血清正常血清（对照）混合做对比试验，免疫血清比正常血清多中和50～100倍剂量的病毒，才能断定是该病毒。、

表23－6　病人双份血清的病毒中和试验结果（组织细胞培养的中和试验）

{| class="wikitable"
|-
| rowspan="2" | 试验病毒（用100个TCLD50）①
| rowspan="2" | 病人血清（取血时期）
| colspan="6" | 活病毒+稀释血清对细胞致病②
| rowspan="2" | 50%终点血清中和抗体效价③ （血清稀释倍数）
|-
| | 1：5
| | 1：10
| | 1：20
| | 1：40
| | 1：80
| | 1：160
|-
| rowspan="2" | [[甲病]]毒
| | 病初（2日）
| | 0000
| | 00++
| | ++++
| | ++++
| | ++++
| | ++++
| | 10（1：10）
|-
| | 病后（20日）
| | 0000
| | 0000
| | 0000
| | 0000
| | 00++
| | ++++
| | 80（1：80
|}

说明：①TCID50=组织培养半数感染剂量。

②每种稀释度接种4支组织细胞培养管；0=未出现细胞致病作用；+=出现细胞致病作用。

③此例的病后血清中和抗体效价比病初血清增高8倍，有诊断意义。

病毒中和抗体的特异性高，持续时间久，以往受[[显性]]或隐性感染后，血中可长期存在中和抗体，所以适用于[[流行病学调查]]或[[人群免疫水平]]研究，但因试验方法繁杂，耗用动物、鸡胚或细胞培养较多，故一般不作常规使用。

'''（三）[[血凝抑制试验]]（Hemagglutinationinhibition test,HIT）'''某些病毒（流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能[[凝集]]红细胞，而抗体与这些病毒结合后却能阻止它们的凝集，若双份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于诊断这类病毒感染。本法简便、快速、经济、特异性高，常用于流行病学调查等。

'''（四）lgM捕捉ELISA''' 特异性lgM出现于病毒感染的早期或病毒感染的活动期，因此可从急性期病人单份血清中检出特异性lgM，这是病毒感染实验室早期诊断的可靠方法。实验中先用u链血清包被微培板孔，用以捕捉血清标本中的lgM类抗体，再加入特异性病毒抗原及酶标抗体以证实特异性lgM的存在。现已广泛用于[[病毒病]]的早期诊断。在先天性感染中，lgM检测有特殊意义，因lgM不能通过[[胎盘]]，新生儿血清中发现抗病毒lgM提示为宫内感染。
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医学微生物学/病毒感染的实验室诊断 - 版本历史

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