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2014-02-05T10:04:21Z

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用[[荧光素]]、[[同位素]]或[[酶标记]][[抗体]]或[[抗原]]，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的[[标记物]]与抗原或抗体[[化学]]连接之后不改变后者的[[免疫]]特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。

'''1．[[免疫荧光技术]]'''　免疫荧光技术（immunofluorescencetechni）是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或[[细胞]]中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。

（1）直接荧光法：把[[荧光抗体]]加到待检的细胞悬液，细胞[[涂片]]或[[组织切片]]上进行[[染色]]，经[[抗原抗体反应]]后，洗去未结合的荧光抗体，将待检[[标本]]在[[荧光显微镜]]下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于[[病毒感染]]细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或[[病原菌]]的检查，也可用于组织中沉着的[[免疫复合物]]的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。

（2）间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的[[荧光标记]]的[[抗免疫球蛋白]]抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的[[免疫球蛋白]]荧光抗体（图20-5）。

{{图片|guzu03yv.jpg|[[免疫荧光]]直接法及间接法原理示意图}}

{{图片|guzu06k1.jpg|免疫荧光直接法及间接法原理示意图}}

图20-5 免疫荧光直接法及间接法原理示意图

免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在[[细菌]]、[[病毒]]、[[螺旋体感染]]的[[疾病]]，检查抗原或抗体，如查出[[IgM]]抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期[[感染]]。除[[微生物学]]方面的应用外，还可利用[[单克隆抗体]]鉴定[[淋巴细胞]]的[[亚类]]。使用[[流式细胞仪]](fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对[[细胞表面]]不同抗原，可以使用两种不同的[[荧光染料]]，如用异硫氰荧光素（FITC）发黄绿荧光，用[[罗丹明]]（TMRITC）发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于[[自身免疫病]]的[[抗核抗体]]检查。

'''2．放射免疫分析法''' 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA）应用竞争性结合的原理，应作[[放射性]]同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定[[抗原抗体结合]]物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、[[抗原抗体复合物]]。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：

（1）液相法：将待检标本（例如含[[胰岛素]]抗原）与定时的[[同位素标记]]的胰岛素（抗原）和定时的[[抗胰岛素]]抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战　性与[[胰岛素抗体]]结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的[[复合物]]越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量（图20-6）。

{{图片|guzu09fl.jpg|液相放射免疫分析法原理及标准曲线}}

{{图片|guzu0c00.jpg|液相放射免疫分析法原理及标准曲线}}

图20-6 液相放射免疫分析法原理及标准曲线

（2）固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰（CNBr）[[海豹]]化的纸片或[[聚苯乙烯]]小管（图20-7）。

{{图片|guzu0c00.jpg|固相放射免疫分析法原理}}

图20-7 固相放射免疫分析法原理

放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种[[激素]]（胰岛素、[[生长激素]]、[[甲状腺素]]等）[[维生素]]、药物、[[IgE]]等。

'''3．[[酶联免疫]]分析法''' 酶联免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA）是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对[[底物]]高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有[[辣根]]过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶（alkaline phosphatase）等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和[[酶联免疫吸附法]]。前者测定[[细胞表面抗原]]或组织内的抗原；后者主要测定[[可溶性抗原]]或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。

{{图片|guzu0ekp.jpg|[[生物素]]－酶标亲合素系统反应示意图}}

图20-8　生物素－酶标亲合素系统反应示意图

（1）[[酶联免疫吸附试验]]（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）:是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行政区。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。

（2）夹心法（sandwichassay）:将已知的[[特异抗体]]包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。

间接法（indirecr ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的[[光密度计]]算出标本中抗体的含量。

（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-[[过氧化物酶]]复合物作为指示剂，组成一新的[[生物]]放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种[[抗原抗体]]系统如细菌、病毒、[[肿瘤细胞]][[表面抗原]]等。一个亲合素（avidin）[[分子]]可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素[[等分]]子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可[[偶联]]90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接[[免疫反应]]系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

表20－1　[[免疫学]]测定方法敏感性比较

{| class="wikitable"
|-
| | 测定方法
| | 敏感性（每升）
|-
| | 单向[[免疫扩散]]试验
| | ＜1～2mg
|-
| | 双向免疫扩散试验
| | ＜1mg
|-
| | 火箭电泳
| | ＜0.5mg
|-
| | [[对流电泳]]
| | ＜0.1mg
|-
| | [[免疫电泳]]
| | ＜5～10mg
|-
| | [[凝集]]试验
| | 1μg
|-
| | 被动[[血凝试验]]
| | 1μg
|-
| | [[血凝抑制试验]]
| | 0.1μg
|-
| | [[补体结合试验]]
| | 0.1μg
|-
| | 放射免疫分析法
| | ＜1pg
|-
| | 酶联免疫吸附试验
| | ＜1ng
|-
| | 定量免疫荧光分析
| | ＜1pg
|}
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医学免疫学/用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应 - 版本历史

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