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2014-02-05T10:06:38Z

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== 一、BCR和TCR[[基因]]重排检测==

对[[血细胞]]恶性变如[[白血病]]、[[淋巴瘤]]等的诊断，长期以来多应用[[细胞形态学]]检查和[[免疫细胞]][[表型]]分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制，对于丢失了[[细胞表面]]标志，或[[分化]]较好难以和正常[[细胞]]区别。也可能由于恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。近年来由于[[分子]][[生物学]]技术的广泛应用，且由于获得了Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆，在此基础上发展了应用Ig基因重排作为B细胞的特异标记，诊断B细胞来源的白血病的和应用TCR基因重排为T细胞特异标志诊断T细胞恶性变引起的白血病，从而将白血病的[[细胞学]]分类法提高到基因水平分析，建立了[[免疫]][[基因型]]诊断的新方法，大大提高了诊断的敏感性和特异性。该方法不但可以确定细胞来源、分化程度，且由于[[DNA]]分析的高度敏感性而能查出[[显微镜]]不能看到的微小变化，从而能监测治疗效果，发现微量残留病变细胞。

该方法首先要从待检的细胞中分离出总DNA。在非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排称为[[胚基]]因（germ line）。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，转移至[[硝酸纤维膜]]或[[尼龙]]膜上，然后用[[同位素]]或[[酶标记]]的Ig血病细胞进行分类鉴定，若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞，若有TCR基因发生重排，则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排，又无TCR基因重排的[[淋巴细胞]]则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。

== 二、[[限制酶切]]片段长度[[多态性]][[组织配型]]法==

迄今，一直是[[血清学]]和细胞学方法进行HLA[[抗原]]结构分析，最近已开始应用分子生物学基因克隆技术进行HLA定型。由于人们已常握了HLA共同和特异的抗原的[[核苷酸序列]]，才有可能用此新方法进行组织配型检验。

限制酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）组织配型技术的原理是目前已掌握了编码HLA抗原的核苷酸序列，包括各[[等位基因]]共有的和专有的序列。HLA-A、-B、-C[[位点]]的Ⅰ类[[重链]]基因的核苷酸序列有高度[[同源性]]，由这些基因片段克隆可得HLAⅠ类专用的[[探针]]，因为检测HLAⅠ[[类抗原]]序列的标志，目前也已得到Ⅱ类抗原特异的探针。由于HLA等位基因的多态性是表现在其核苷酸序列的差异上，由这些基因中克隆出的特异DNA片段，就可检测这些基因的差别。由于核苷酸序列不同，被[[限制性内切酶]]作用部位（切点）也不同，这种酶切点只有4～6个[[核苷酸]]长度。因此来源于不同HLA[[单倍型]]的DNA可被一种[[内切酶]]切成不同长度的片段。在实际工作中，从细胞中提取[[基因组]]DNA（genomic DNA）的多态性比实际HLA-Ⅱ类抗原的多态性还要复杂，因为基因的[[内含子]]（不[[转录基因]]）序列不同，和[[外显子]]（[[转录]]并翻译成[[蛋白质]]）序列差别均在酶切后的细胞总DNA中。

RFLP组织配型检测主要包括4个步聚（印迹）：①提取细胞总DNA，用限制性内切酶[[消化]]；②[[凝胶电泳]]；③将[[凝胶]]中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上；④经变性处理后用[[同位素标记]]的探针进行[[分子杂交]]。经[[放射自显影]]，得到显影带（bands）。即可得知[[分子量]]大小不同的DNA片段（图20-9）。

{{图片|guzu0qql.jpg|用RFLP进行组织定型比较三个[[标本]]的组织定型}}

图20－9用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型

RFLP组织配型实验是用于血清学或细胞学检测失败的样品，如HLA抗原不表达（[[裸细胞]]）细胞脆性大而破碎，[[淋巴细胞减少]]没有足够的样品时。由于分子[[生物学方法]]采样少、特异、敏感的优点可弥补常规方法的不足。此外，RFLP组织配型法还可查出DNA[[变异]]及[[基因重组]]的情况，而血清学方法则不能。PFLP组织配型为[[器官移植]]、[[骨髓移植]]选择适宜的[[供体]]，用比较供体，[[受体]]限制酶切片段的长度的差异。两者的RFLP越接近。差别越小，[[移植]]效果越好，近年来发展的PCR-RFLP以其简单、敏感、可靠、价廉且无需同位素等优点，已取代了RELP法。
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