112.247.109.102：以“{{Hierarchy header}} 探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法...”为内容创建页面

2014-01-26T14:28:57Z

以“{{Hierarchy header}} 探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法...”为内容创建页面

新页面

{{Hierarchy header}}
[[探针]]制备就是目的[[基因]]的标记，[[核酸]]标记方法常用的有缺口平移法、随机[[引物]]法、[[末端标记]]法等。[[标记物]]质有[[放射性]]元素（如32P等）和非[[放射性物质]]（如[[生物素]]、[[地高辛]]等）。32P是最常用的[[核苷酸]]标记[[同位素]]，被标记的dNTP本身就带有[[磷酸基]]团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β[[射线]]能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用32P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚[[聚甲基丙烯酸甲酯]]有机玻璃[[隔离]]保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它[[同位素标记]]物，同样应注意[[放射线]]防护。

非[[放射性标记]]有酶标和化学物标记法。酶标方法与[[免疫]]测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的[[抗体]]，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。[[血凝素]]（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上[[过氧化物酶]]或[[碱性磷酸酶]]（血凝素-酶），经[[杂交反应]]最终形成：探针-生物素-血凝素-酶[[复合物]]（ABC法）。酶[[催化]][[底物]]显色，观察结果。与一般的[[酶反应]]底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。[[酶标记]]法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。[[化学]]标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。（表18-1）

表18-1　探针标记及特性

{| class="wikitable"
| 标记物
| 检测方法
| 特点
|-
| 32P
| β射线，自显影
| 灵敏度最高，半寿期14天，放射强度1.7MeV
|-
| 35S
| β射线，自显影
| 灵敏度高，分辨率好，半寿期87天，0.17MeV
|-
| 3H
| β射线，自显影
| 低敏度高，分辨率高，半寿期12年，0.01MeV
|-
| 125I
| γ射线，自显影
| 灵敏度高，分辨率高，半寿期60天，0.04MeV
|-
| 生物素
| 酶标血凝素，显色
| 灵敏度好，避免有内源性生物素[[标本]]
|-
| 地高辛
| 酶标地高辛[[配体]]，显色
| 灵敏度好，分辨率一般
|-
| T-T[[二聚体]]
| 酶标抗二聚体抗体，显色
| 灵敏度好，紫外照射形成二聚体而标记
|-
| BrdU
| 酶标抗BrdU抗体，显色
| 灵敏度好，[[细菌]]内含[[质粒]]复制掺入
|-
| 铕-[[补骨脂素]]
| 荧光
| 灵敏度一般
|}

[[缺口平移]]标记法先由DNase Ⅰ在[[DNA]]双链上切出随机切口，DNA[[聚合酶]]Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。（图18-4、5）

缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（＞1000bp最好），[[单链DNA]]、[[RNA]]不能用该法标记。随机引物法具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但不能标记环状DNA。利用[[末端转移酶]]可进行“尾标”，尾标适用于[[寡核苷酸探针]]标记，用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记，因mRNA的多聚（A）尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”[[突变]]检测，该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长，特异性

{{图片|gor4usrj.jpg|DNA随机引物标记法}}

图18-5　DNA随机引物标记法

好，标记量大，杂交检出信号强。合成探针长度短，一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意[[碱基组成]]G≡C含40％-60％，一种[[碱基]]连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构，影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外，还有利用M13[[噬菌体]]载体可复制单链DNA的特点，复制合成DNA探针，利用[[转录]]载体（DNA），转录合成RNA探针。下面就GIBCoBRL公司（Bethesda Research Laboratories美国）的缺口平移法标记生物素[[试剂盒]]（bionick labeling system）为例介绍如下：

{| class="wikitable"
| [[试剂]]：
| 10x dNTP Mix.250μl
| 10x Enzyme Mix 250μl
|-
|
| 0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP
| 0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ
|-
|
| 0.1mmol/L dATP
| 0.0075 units/μl DNase Ⅰ
|-
|
| 0.1mmol/L biotin-14-dATP
| 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
|-
|
| 500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)
| 5mmol/L magnesium acetate
|-
|
| 50mmol/L MgCl2
| 1mmol/L β-mercaptoethanol
|-
|
| 100mmol/L β-mercaptoethanol
| 0.1mmol/L phenylmethyl-
|-
|
|
| sulfonyl fluoride
|-
|
|
|
|-
|
| 100μg/ml nuclease-free BSA
| 50％（v/v）glycerol
|-
|
|
| 100μg/ml nuclease-free BSA
|-
|
| Control DNA：5μg pBR322 in TE
|
|-
|
| stop buffer 300 mM EDTA
|
|-
|
| autoclaved H2O
|
|}

操作步骤：

将5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相当1μg需标记的DNA量）；－μl[[灭菌]][[蒸馏水]]加至45μl；再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml[[离心管]]后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。[[乙醇]]沉淀，备用。
{{Hierarchy footer}}
{{临床生物化学图书专题}}

临床生物化学/探针制备 - 版本历史

112.247.109.102：以“{{Hierarchy header}} 探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法...”为内容创建页面