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2014-01-26T14:29:59Z

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建立[[基因库]]的目的是为了便于目的[[基因]]的保存、[[扩增]]和[[纯化]]。基因库是利用工具酶，通过[[基因重组]]技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等[[生物]]如[[细菌]]、[[病毒]]、[[噬菌体]]等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种[[核酸]]扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，[[重组]]于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。

'''（一）基因重组'''

基因重组方案很多，简单的可用同一种[[限制性内切酶]]分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端[[连接酶]]合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。

'''（二）转化'''

转化目的是把有复制能力，但在[[细胞]]外无复制活性的目的基因-载体[[重组体]]装入细胞（[[大肠埃希菌]]），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：

{{图片|gor4ty0a.jpg|基因重组方案之一}}

图18-3　基因重组方案之一

⒈大肠埃希菌的处理（增加[[细胞膜]]通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）[[接种]]于Lb agar[[培养基]]，37℃培养一晚。挑选3~5个大[[菌落]]，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A550测定，要求[[细菌繁殖]]一定量（一般为细菌对数[[生长期]]），[[野生型]]（rec＋，5x107cells/ml）为0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去[[上清液]]，用20ml，50mmol/L，CaCl2悬浮菌体。冰浴20分钟，[[低温]]离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。

⒉[[质粒]]（如经基因重组建立的[[重组质粒]]，基因库等）的转化将competent cells（以美国BRL公司DH10B[[菌株]]为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）[[塑料试管]]置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059[[试管]]中，加10倍稀释的[[巯基]][[乙醇]]1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-[[氨芐青霉素]]（100U/ml）[[培养皿]]，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB[[培养液]]中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。

LB培养基（1L）：10g[[蛋白胨]]，5g[[酵母膏]]，10gNaCl，[[高压灭菌]]，pH7.5。

SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L[[氯化镁]]与1mol/L[[硫酸镁]]等量混匀，过滤[[灭菌]]），临用前加1ml于100ml培养基。

SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L[[葡萄糖]]。
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临床生物化学/基因库的建立 - 版本历史

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