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2014-01-26T14:30:07Z

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'''（一）载体'''

载体（Vector）是把外源[[DNA]]（目的[[基因]]）导入[[宿主]][[细胞]]，使之[[传代]]、[[扩增]]、表达的工具。载体有[[质粒]]（plasmid）、[[噬菌体]]、[[单链]]丝状噬菌体和[[粘性末端]]质粒（粘粒）、[[病毒]]等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的[[遗传标记]]；有供外源DNA插入的[[位点]]；本身体积小等特征。

质粒存在于多种[[细菌]]，是[[染色体]]（核）以外的独立[[遗传因子]]，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有[[蛋白质]]结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA[[多聚酶]]Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用[[氯霉素]]可阻止[[蛋白质合成]]，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗[[抗生素]]标记（抗[[氨芐青霉素]]Apr、[[抗四环素]]Tcr等）或大肠埃希菌部分[[乳糖]][[操纵子]]（E.coli LacZ）等，便于[[基因重组]]体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、[[色氨酸]]操纵子Trp等）和[[转录终止]]序列，便于插入的[[外源基因]][[转录]]、翻译表达。质粒上还有许多[[限制性内切酶]]的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。

常用噬菌体载体有[[单链噬菌体]]M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

'''（二）工具酶'''

工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、[[连接酶]]、[[核酸]][[聚合酶]]、[[逆转录酶]]、[[核酸酶]]等。

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA[[内切酶]]之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的[[核苷酸]]处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、[[缓冲液]]用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。

{| class="wikitable"
| 酶
| 识别序列
| 切口
|
|-
| Alu Ⅰ
| …AGCT…
| …AG [[CT]]…
| 四核苷酸
|-
|
| …TCGA…
| …[[TC]] GA…
| 平端切口
|-
| Eco R1
| …GAATTC…
| …G AATTC…
| 六核苷酸
|-
|
| …CTTAAG…
| …CTTAA G…
| 粘端切口
|}

连接酶有[[T4]]噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体[[RNA]]连接酶、[[大肠埃希菌]]DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有[[Mg]]2+和[[ATP]]存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有[[逆转录]]活性）。

大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切[[酶活性]]。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被[[枯草杆菌]]酶作用产生的一个大片段，有5′→3′[[聚合酶和]]5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA[[序列测定]]，修补DNA链等。

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解[[单链DNA]]和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的[[发夹环]]。

[[末端转移酶]]在Mg2+存在下，选择3′－OH端单链DNA为[[引物]]加成核苷酸，在Co2+存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸[[末端标记]]和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

[[碱性磷酸酶]]去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA[[分子]]之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图18-1）。

{{图片|gor4s1hc.jpg|经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接}}

图18-1　经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接
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临床生物化学/基因工程的常用工具 - 版本历史

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